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HTRF (H) ATM P-S1981 KIT - 10K PTS

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品牌： Revvity

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概述

这种基于 HTRF 的细胞检测方法能够快速、定量地检测丝氨酸 1981（Ser1981）位点磷酸化的 ATM，可作为 DNA 损伤应答（DDR）中 ATM/CHK2 信号通路的读出指标。该试剂盒与磷酸化 CHK2 苏氨酸 68 检测试剂盒相辅相成，适用于 ATM-CHK2 通路的研究。

当细胞遭遇双链断裂（DSBs）等 DNA 损伤时，ATM-Chk2 通路和复制检查点应答会被激活。这些通路会介导 G1/S 期检查点，使细胞周期进程停滞，为 DNA 修复争取额外时间。

在应对 DNA 双链断裂时，ATM 会发生自磷酸化，形成有活性的单体激酶。ATM 激活后，会导致多种下游靶标磷酸化，如 H2A 组蛋白家族成员 X（H2Ax）、检查点激酶 Chk2 及其下游效应分子。

工作原理

HTRF 磷酸化 ATM 检测原理

磷酸化 ATM（Ser1981）检测用于测定丝氨酸 1981 位点磷酸化的 ATM。与蛋白质印迹法不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。

磷酸化 ATM（Ser1981）检测使用两种标记抗体：一种标记供体荧光团，另一种标记受体荧光团。第一种抗体经筛选可特异性结合蛋白质上的磷酸化基序，第二种抗体则能不依赖蛋白质的磷酸化状态识别该蛋白质。蛋白质磷酸化会促使两种标记抗体形成免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生 FRET 信号。信号强度与样品中磷酸化蛋白质的浓度直接成正比，且该检测采用免洗涤格式，为评估蛋白质的磷酸化状态提供了便利。

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HTRF 磷酸化 ATM Ser1981 双板检测方案

双板方案的步骤为：先在 96 孔板中培养细胞，裂解后将裂解物转移至 384 孔低体积检测板，再加入磷酸化 ATM Ser1981 HTRF 检测试剂。

该方案可监测细胞的活力和汇合度。

HTRF 总 BRD2 检测的双板方案

HTRF 磷酸化 ATM Ser1981 单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测磷酸化 ATM Ser1981 可在单个培养板中完成，该培养板同时用于细胞培养、刺激和裂解，无需洗涤步骤。

这种为高通量筛选（HTS）设计的方案可实现小型化操作，同时保持稳定的 HTRF 检测质量。

HTRF 总 BRD2 检测的单板方案

检测验证

新制癌菌素对总 ATM 和磷酸化 Ser1981 ATM 检测的影响

将人 HEK293 细胞以 100,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔培养处理板中，加入完全培养基，在 37°C、5% CO₂条件下孵育过夜。用不同浓度的新制癌菌素处理细胞 2 小时（37°C、5% CO₂）。随后，加入 50µl 补充的 1X 裂解缓冲液 #1，在室温下轻轻振荡 30 分钟裂解细胞。细胞裂解后，取 16µL 裂解物转移至 384 孔低体积白色微孔板中，再加入 4µL HTRF 磷酸化 ATM（Ser1981）或总 ATM 检测试剂。室温孵育过夜后记录 HTRF 信号。

如预期所示，新制癌菌素会诱导单链和双链 DNA 损伤，导致 ATM 磷酸化呈剂量依赖性增加，而对总 ATM 蛋白的表达水平无影响。

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诱导 DNA 损伤的化合物对 ATM 磷酸化（Ser1981）和总蛋白的影响

将人 HEK293 细胞以 100,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔培养处理板中，加入完全培养基，在 37°C、5% CO₂条件下孵育过夜。用不同浓度的新制癌菌素、羟基脲、阿霉素和依托泊苷处理细胞 2 小时（37°C、5% CO₂）。移除培养基后，加入 50µl 补充的 1X 裂解缓冲液 #1，在室温下轻轻振荡 30 分钟裂解细胞。细胞裂解后，取 16µL 裂解物转移至 384 孔低体积白色微孔板中，再加入 4µL HTRF 磷酸化 ATM（Ser1981）或总 ATM 检测试剂。室温孵育过夜后记录 HTRF 信号。

不同化合物呈现出不同的应答。已知新制癌菌素、阿霉素和依托泊苷会诱导双链断裂，在此实验中导致 ATM 磷酸化；而羟基脲主要诱导单链断裂，仅引起部分 ATM 磷酸化，且效力较弱。新制癌菌素、阿霉素、依托泊苷和羟基脲的半数有效浓度（EC50）分别为 0.2µM、1.4µM、0.9µM 和 0.3mM。

此外，新制癌菌素的 80% 有效浓度（EC80）经评估为 1µM，该浓度用于评估 ATM/CHK2 通路抑制剂。

这 4 种化合物均未影响总 ATM 蛋白的表达水平。

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ATR/CHK1 或 ATM/CHK2 通路抑制剂对 HTRF 磷酸化 Ser1981 和总 ATM 试剂盒的影响

将人 HEK293 细胞以 100,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔培养处理板中，加入完全培养基，在 37°C、5% CO₂条件下孵育过夜。用不同浓度的 3 种 ATR 或 ATM 通路抑制剂处理细胞 2 小时（37°C、5% CO₂），随后用 1µM 新制癌菌素（EC80）继续处理 2 小时（37°C、5% CO₂）。移除培养基后，加入 50µl 补充的 1X 裂解缓冲液 #1，在室温下轻轻振荡 30 分钟裂解细胞。细胞裂解后，取 16µL 裂解物转移至 384 孔低体积白色微孔板中，再加入 4µL HTRF 磷酸化 ATM Ser1981 或总 ATM 检测试剂。室温孵育过夜后记录 HTRF 信号。

已知咖啡因是温和的 ATR/ATM 通路抑制剂，UCN-1 是强效 CHK1 抑制剂，KU55933 是选择性 ATM 通路抑制剂。如预期所示，UCN-1 对 ATM 磷酸化无影响；咖啡因会降低 ATM 磷酸化，但效力较弱；KU55933 能完全抑制 ATM 磷酸化，且效力更强。

这 3 种化合物均未影响总 ATM 蛋白的表达水平。

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简化通路

ATM/CHK2 和 ATR/CHK1 信号通路

DNA 双链断裂（DSBs）或单链断裂（SSBs）是威胁基因组完整性的最有害损伤之一。它们可由细胞代谢物或 DNA 损伤剂（如遗传毒性化合物、化疗药物、紫外线（UV）照射或电离辐射）诱导产生。

DNA 损伤应答（DDR）主要由共济失调毛细血管扩张症突变蛋白（ATM）和共济失调毛细血管扩张症及 Rad3 相关蛋白（ATR）控制，二者均属于磷酸肌醇 3 - 激酶（PI3K）相关激酶（PIKK）蛋白激酶家族。

当细胞受到 DNA 损伤（DSBs）时，ATM-Chk2 通路和复制检查点应答会被激活，介导 G1/S 期检查点以停滞细胞周期进程，为 DNA 修复争取时间。

在应对 DNA 双链断裂时，ATM 会发生自磷酸化，形成有活性的单体激酶。ATM 激活后会导致多种下游靶标磷酸化，如 H2A 组蛋白家族成员 X（H2Ax）、检查点激酶 Chk2 及其下游效应分子。

新的 ATM 小分子抑制剂的发现，以及新的检查点调控策略的设计和验证，与传统的放疗和化疗相结合，有望改善癌症的治疗效果。

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规格

其他规格

应用：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
裂解缓冲液兼容性：裂解缓冲液 1、裂解缓冲液 4
分子修饰：磷酸化
产品类别：试剂盒
样品体积：16 µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷酸化蛋白
靶标物种：人类
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
单位规格：10,000 个检测点

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货号：64ATMS1PEH

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