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HTRF (H) AUR A TOTAL KIT - 10K PTS

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概述

这种基于 HTRF 的细胞检测方法可便捷、准确地检测在真核生物中广泛表达的人源 Aurora A 蛋白（与 AURKA 基因相关）。Aurora A 属于丝氨酸 / 苏氨酸 Aurora 激酶家族（包括 Aurora B 和 Aurora C），通过调控有丝分裂（尤其是染色体分离过程）在细胞分裂中发挥关键作用。它通过苏氨酸 288（Thr288）残基的自磷酸化被激活，该过程主要发生在细胞分裂周期的 S 期晚期至 M 期，或 DNA 损伤应答过程中。Aurora 激酶在多种癌症（白血病、结肠癌、前列腺癌和乳腺癌）中存在过表达，这使其成为 Aurora 激酶抑制剂（AKIs）研发的重要靶点。

工作原理

总 Aurora A 检测原理

总 Aurora A 检测用于定量细胞裂解物中 Aurora A 的表达水平。与蛋白质印迹法不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。总 Aurora A 检测使用两种标记抗体：一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。两种抗体均对该蛋白上的特定表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在 Aurora A 时，加入这些偶联物会使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生 FRET 信号。信号强度与样品中该蛋白的浓度直接成正比，并在免洗涤的检测格式下为评估蛋白表达水平提供了手段。

1phospho-how-it-works-atg14-total-assay-principle.svg（总 Aurora A 检测原理示意图）

总 Aurora A 双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，然后裂解细胞，再将裂解物转移至 384 孔低体积检测板，之后加入总 Aurora A HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

HTRF 总 BRD2 检测的双板方案

总 Aurora A 单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测总 Aurora A 可在单个培养板中完成，该培养板同时用于细胞培养、刺激和裂解，无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案可实现小型化操作，同时保持稳定的 HTRF 检测质量。

HTRF 总 BRD2 检测的单板方案

检测验证

在 HeLa 细胞中检测总 Aurora A 和磷酸化 Aurora A（Thr288）的激活情况

将 HeLa 细胞（永生化人宫颈癌细胞系）以 100,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔培养处理板中，在完全培养基中培养 24 小时使其贴壁。移除细胞培养基后，用浓度递增的诺考达唑在 37°C、5% CO₂条件下处理细胞 20 小时。过夜处理（20 小时）后，移除细胞培养基，向每孔中加入 50µl 补充的 1X 裂解缓冲液 #1，在室温下轻轻振荡 30 分钟。细胞裂解后，将 16µL 裂解物转移到 384 孔低体积白色微孔板中，并加入 4µL HTRF 总 Aurora A 或磷酸化 Aurora A（Thr288）检测抗体。过夜孵育后记录 HTRF 信号。

诺考达唑是一种微管去稳定剂，可诱导 G2/M 期细胞周期阻滞。已有研究表明，经诺考达唑处理的细胞会通过提高 Aurora 蛋白表达水平来克服细胞周期阻滞 [1]。

正如预期，结果显示经诺考达唑处理后，总 Aurora A 蛋白和 Thr288 磷酸化 Aurora A 蛋白的水平均有所增加。

[1]：Jiang 等人，《癌基因》，2003 年

1assay-validation-aurora-a-total-pharmaco-1.svg（在 HeLa 细胞中检测总 Aurora A 和磷酸化 Aurora A 激活情况的结果图）

在 HeLa 细胞中利用磷酸化 Aurora A（Thr288）和总 Aurora A 对抑制剂进行表征

2assay-validation-aurora-a-total-pharmaco-2-1.svg、3assay-validation-aurora-a-total-pharmaco-2-2.svg（相关结果图）

经阿利塞替尼处理的 HeLa 细胞中的总 Aurora A 和磷酸化 Aurora A

将 HeLa 细胞（永生化人宫颈癌细胞系）以 100,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔培养处理板中，在完全培养基中培养 24 小时使其贴壁。移除细胞培养基后，用浓度递增的抑制剂（MLN8054、托沙替尼、阿利塞替尼）与 200nM 的固定浓度诺考达唑共同孵育，在含 5% 胎牛血清的细胞培养基中于 37°C、5% CO₂条件下处理 20 小时。过夜处理后，移除细胞培养基，向每孔中加入 50µl 补充的 1X 裂解缓冲液 #1，在室温下轻轻振荡 30 分钟。细胞裂解后，将 16µL 裂解物转移到 384 孔低体积白色微孔板中，并加入 4µL HTRF 总 Aurora A 或磷酸化 Aurora A（Thr288）检测抗体。过夜孵育后记录 HTRF 信号。

文献中已证实这 3 种化合物对磷酸化 Aurora A（Thr288）具有抑制作用，最大抑制率可达 98%，且不影响总蛋白水平 [2,3,4,5]。

正如预期，结果显示经 MLN8054、托沙替尼或阿利塞替尼处理后，Aurora A 在 Thr288 位点的磷酸化水平呈明显的剂量依赖性降低，而 Aurora A 蛋白的表达水平保持不变。

[2]：Manfredi 等人，《美国国家科学院院刊》，2006 年
[3]：Sells 等人，《ACS 药物化学快报》，2015 年
[4]：Tyler 等人，《细胞周期》，2007 年
[5]：Qi 等人，《白血病研究》，2013 年

1assay-validation-aurora-a-total-pharmaco-1.svg（相关结果图）

利用基因沉默（小干扰 RNA）验证 HTRF 总 Aurora A 检测的特异性和选择性

在 96 孔板中（25,000 个细胞 / 孔），用 25nM 的 SMARTPool ON-TARGETplus 小干扰 RNA（Horizon）分别特异性靶向 Aurora A（#L-003545-01-0005）、Aurora B（#L-003326-00-0005）和 Aurora C（#L-019573-00-0005）处理 HeLa 细胞，或用非靶向小干扰 RNA（#D-001810-10-20，作为对照）处理，在 100µL 体系中处理 24 小时。移除细胞培养基后，在完全细胞培养基中加入 300nM 诺考达唑刺激细胞，在 37°C、5% CO₂条件下再孵育 24 小时。移除培养基后，用 50µL 1X 裂解缓冲液 #1 在室温下轻轻振荡 30 分钟裂解细胞，将 16µL 裂解物转移到低体积白色微孔板中，然后加入 4µL 预混合的 HTRF 总 Aurora A 检测抗体。在室温下过夜孵育后记录 HTRF 信号。

用 Aurora A 小干扰 RNA 处理细胞后，Aurora A 显著下调，与转染非靶向小干扰 RNA 的细胞相比，信号降低了 44%。

尽管这 3 种家族蛋白同源性较高，但用 Aurora B 或 Aurora C 小干扰 RNA 处理的细胞未出现信号降低，这证明了该试剂盒的特异性和选择性。

5assay-validation-aurora-a-total-pharmaco-4.svg（相关结果图）

在多种人细胞系上的验证

将永生化人细胞系 HepG2（肝癌）、HeLa（宫颈癌）、HEK293 和 HCT116（结肠癌）以 25,000 或 100,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔培养板中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时。移除细胞培养基后，在完全细胞培养基中加入 300nM 诺考达唑，在 37°C、5% CO₂条件下刺激 20 小时。移除培养基后，用 50µL 补充的 1X 裂解缓冲液 #1 在室温下轻轻振荡 30 分钟裂解细胞。

使用 HTRF 总 Aurora A 试剂盒评估 Aurora A 蛋白的表达水平。简要步骤为：将 16µL 细胞裂解物转移至低体积白色微孔板中，然后加入 4µL 预混合的 HTRF 检测试剂。室温过夜孵育后记录 HTRF 信号。

在所有测试的人细胞系中，均能检测到不同水平的 Aurora A 蛋白。对于特定的细胞模型，必须优化细胞密度以使其处于试剂盒的动态范围内。值得注意的是，HepG2 细胞中 Aurora A 蛋白表达水平较高，因此与 HeLa、HEK293 或 HCT116 细胞（25,000 至 100,000 个细胞 / 孔）相比，HepG2 细胞需使用更低的密度（25,000 个细胞 / 孔或更低）才能处于动态范围内。

HTRF 总 Aurora A 检测能有效检测多种表达不同水平该蛋白的人细胞模型中的内源性 Aurora A 蛋白。

6assay-validation-aurora-a-total-pharmaco-5.svg（相关结果图）

HTRF 总 Aurora A 检测与蛋白质印迹法的比较

将 HeLa 细胞在 T175 培养瓶中的完全培养基中于 37°C、5% CO₂条件下培养。孵育 24 小时后，先用 300nM 诺考达唑在 37°C、5% CO₂条件下刺激 20 小时，然后用 3mL 补充的 1X 裂解缓冲液 #1 在室温下轻轻振荡 30 分钟裂解细胞。

使用补充的裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，将 16µL 每种稀释液转移至低体积白色微孔板中，然后加入 4µL HTRF 总 Aurora A 检测试剂。使用等量的裂解物进行 HTRF 与蛋白质印迹法的平行比较。

蛋白质印迹法与 HTRF 的平行比较表明，至少在这些实验条件下，HTRF 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 4 倍。

7assay-validation-aurora-a-total-pharmaco-6.svg（相关结果图）

简化通路

简化的 Aurora A 信号通路

Aurora 激酶是一类丝氨酸 / 苏氨酸激酶，包括 Aurora A（AURKA）、Aurora B（AURKB）和 Aurora C（AURKC），通过调控有丝分裂（尤其是染色体分离过程）在细胞分裂中发挥关键作用。

Aurora A 通过其激活环上苏氨酸 288 残基的自磷酸化被激活，该过程主要发生在细胞分裂周期的 S 期晚期至 M 期，或 DNA 损伤应答过程中。该激活需要多种辅助因子，包括微管相关蛋白 TPX2 和 INCENP。Aurora A 可磷酸化多个靶标，例如 PLK1（与辅助因子 Bora 结合）以激活 PLK1 级联反应，从而调控有丝分裂和纺锤体组装的关键方面，或激活 DNA 损伤应答中的恢复通路。Aurora A 通过蛋白磷酸酶 1（PP1）对苏氨酸 288 的去磷酸化而失活。Aurora 激酶在多种癌症（白血病、结肠癌、前列腺癌和乳腺癌）中存在过表达，这使其成为 Aurora 激酶抑制剂（AKIs）研发的重要候选靶点。

8pathway-aurora-a-total.svg（简化的 Aurora A 信号通路示意图）

规格

应用：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
兼容的裂解缓冲液：1 号裂解缓冲液、4 号裂解缓冲液
分子修饰：总量
产品类别：试剂盒
样品体积：16µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷酸化蛋白
靶标物种：人类
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
单位规格：10,000 个检测点

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货号：64AURATPEH

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