HTRF VHL - RED LIGAND VHL蛋白/红色配体标准品

产品概述

HTRF VHL-Red 配体主要用于采用HTRF®技术对VHL蛋白进行亲和力结合曲线测定。

VHL，即von Hippel-Lindau蛋白，参与多种生物学过程，与血管生成、细胞生长及细胞存活的调控密切相关。VHL是双功能蛋白降解靶向嵌合体（PROTAC）分子最常招募的E3泛素连接酶之一，用于诱导目标蛋白的泛素化及随后的蛋白酶体降解。VHL与多种蛋白相互作用，形成具有功能的von Hippel-Lindau泛素化复合物。在该复合物中，VHL充当E3泛素连接酶复合物的靶标募集亚基，在常氧条件下将羟化的缺氧诱导因子（HIF）等多种蛋白靶向至蛋白酶体进行降解。

识别新型PROTAC VHL配体有助于改善对目标蛋白的选择性蛋白酶体依赖性降解，这些蛋白参与癌症等疾病的发生发展。

HTRF VHL-Red 配体主要用于开展协同性结合研究。该试剂可在目标蛋白存在的情况下，计算VHL-Red配体与VHL蛋白的亲和力。通过测定在目标蛋白缺失和存在两种条件下，HTRF VHL-Red配体与VHL蛋白结合的最大结合容量（Bmax）和解离常数（Kd），可为使用HTRF人源VHL结合检测试剂盒评估协同效应提供所需的精准初步分析数据。

工作原理

HTRF VHL配体结合检测原理
HTRF VHL-Red配体的结合通过直接结合检测模式进行检测，使用抗6His-铕穴状化合物抗体与带有6His标签的人源VHL蛋白复合物结合。当供体与受体荧光基团足够靠近时，光源（激光或闪光灯）激发供体，触发荧光共振能量转移（FRET）至受体，受体随即在特定波长（665 nm）发射荧光（图A）。特异性结合信号通过从总信号中减去非特异性结合信号计算得出，从而实现对HTRF VHL-Red配体的Kd测定（图B）。

HTRF VHL-Red配体结合检测方案
HTRF VHL-Red配体的饱和结合实验可在384孔板中运行，操作如下：首先分装5 µL稀释液9缓冲液（用于总结合）或VHL结合标准品（用于非特异性结合）。随后加入5 µL PROTAC结合缓冲液1（作为参照）或稀释于PROTAC结合缓冲液1中的目标蛋白（用于协同性研究），接着加入5 µL 6His标签VHL蛋白复合物。最后加入5 µL预混合的HTRF VHL-Red配体与抗6His-铕穴状化合物抗体溶液。

室温孵育1小时后，读取HTRF比值。

检测详情

检测验证

在目标蛋白存在条件下VHL-Red配体亲和力（Kd）的测定
本例中，以目标蛋白CRBN为例，评估了在CRBN蛋白缺失和存在两种条件下，VHL-Red配体与6His-VHL蛋白复合物的结合亲和力（Kd），作为CRBN/VHL PROTAC化合物初步协同性研究的示例。结果表明，65 nM CRBN蛋白的存在不改变VHL-Red配体的Kd值。

技术规格