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HTRF (H) BRD3 TOTAL KIT - 500 PTS

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概述

BRD3 属于溴结构域（BRD）家族 II（BET 家族）。与其他 BRD 家族蛋白一样，它可与乙酰化赖氨酸结合，充当组蛋白等蛋白质赖氨酸乙酰化状态的 “阅读器”。作为一种转录调节因子，它通过 E2F-RB 通路参与许多细胞过程（胚胎发生、周期调控、发育）。BRD3 与 GATA 转录因子相互作用，以实现其染色质占据并调控多种癌基因（如 c-MYC）。

因此，抑制 BRD3 的功能已成为癌症治疗策略的一部分。最近，通过 PROTAC 分子靶向包括 BRD3 在内的 BET 家族蛋白降解，已成为一种新颖且极具前景的治疗方法。

工作原理

总 BRD3 检测原理

HTRF 总 BRD3 检测用于定量细胞裂解物中 BRD3 的表达水平。与蛋白质印迹法不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。总 BRD3 检测使用两种标记抗体：一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。两种抗体均对该蛋白上的特定表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在 BRD3 时，加入这些偶联物会使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生 FRET 信号。信号强度与样品中该蛋白的浓度直接成正比，并在免洗涤的检测格式下为评估蛋白表达水平提供了手段。

HTRF 总 BRD3 检测原理

总 BRD3 双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，然后裂解细胞，再将裂解物转移至 384 孔低体积检测板，之后加入总 BRD3 HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

HTRF 总 BRD3 检测双板方案

总 BRD3 单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测总 BRD3 可在单个培养板中完成，该培养板同时用于细胞培养、刺激和裂解，无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案可实现小型化操作，同时保持稳定的 HTRF 检测质量。

HTRF 总 BRD3 检测单板方案

检测验证

在多种人细胞系上的验证

将贴壁人细胞系 MCF7（乳腺）、HEK293（胚胎肾）和 HeLa（宫颈）以 100,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔培养板中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时。移除培养基后，用 50µL 补充的 4 号裂解缓冲液（1X）裂解细胞。

使用 HTRF 总 BRD3 试剂盒评估 BRD3 的表达水平。简要步骤为：将 16µL 细胞裂解物转移至低体积白色微孔板中，然后加入 4µL 预混合的 HTRF 检测试剂。室温过夜孵育后记录 HTRF 信号。虚线对应非特异性 HTRF 信号。值得注意的是，预先对细胞密度进行了优化，以确保 HTRF 检测处于试剂盒的动态范围内（数据未显示）。

HTRF 总 BRD3 检测能有效检测多种表达不同水平该蛋白的细胞模型中的 BRD3。

总 BRD3 检测在多种细胞系上的验证

PROTAC® 诱导的 BRD3 降解

总 BRD3 检测的药理学验证 ——HeLa 细胞上的 PROTAC

总 BRD3 检测的药理学验证 ——HeLa 细胞上的 GAPDH

PROTAC®	所述 POI	弹头	E3L 配体	已公布效力	DC50
dBET6	BET 家族	JQ1 衍生物	沙利度胺（脑啡肽配体）	14-50 nM	67 nM
ARV-771	BET 家族	JQ1 衍生物	VHL-1（VHL 配体）	8-34 nM	33 nM
MZP-54	BET 家族	I-BET726	VH032（VHL 配体）	50-300 nM	22 nM
dBRD9	BRD9 选择性	BI7273	泊马度胺（脑啡肽配体）	非靶向 BRD3	无降解
ARV-471	ERα	与 BRD2 靶标无关			无降解

使用敲除 HAP1 细胞系验证 HTRF 总 BRD3 检测的特异性

使用 HTRF 总 BRD3 试剂盒评估 HAP1 细胞（野生型）和五种不同的 HAP1 敲除细胞系（分别敲除 BRD2、BRD4（BET 家族）、BRD7 或 BRD9（家族 IV））中 BRD3 的表达水平。预先对细胞密度进行了优化，以确保 HTRF 检测处于试剂盒的动态范围内（数据未显示）。

将这 6 种不同的细胞系在 96 孔板中（50,000 个细胞 / 孔）于 37°C、5% CO₂条件下培养 24 小时。移除培养基后，用 50µL 补充的 4 号裂解缓冲液（1X）裂解细胞，将 16µL 细胞裂解物转移至低体积白色微孔板中，然后加入 4µL 预混合的检测试剂。室温过夜孵育后记录 HTRF 信号。

在 HAP1 BRD3 敲除细胞中，HTRF 信号与非特异性信号（虚线）相当，表明 BRD3 基因被完全沉默，而正如预期的那样，在其他细胞系中可很好地检测到 BRD3 水平。

值得注意的是：i）与野生型 HAP1 细胞相比，在 BRD2、BRD4、BRD7 和 BRD9 敲除细胞系中未检测到 BRD3 水平的降低，这表明 HTRF BRD3 试剂盒相对于 BRD2、BRD4、BRD7 和 BRD9 具有选择性；ii）在 HAP1 BRD2 敲除细胞和 HAP1 BRD4 敲除细胞中，BRD2 和 BRD4 的表达水平显著高于野生型 HAP1 细胞，这提示存在代偿机制。

使用敲除 HAP1 细胞系验证总 BRD3 检测的特异性

HTRF 总 BRD3 检测与蛋白质印迹法的比较

将 HeLa 细胞在 T175 培养瓶中的完全培养基中于 37°C、5% CO₂条件下培养。孵育 48 小时后，移除细胞培养基，用 3mL 补充的 4 号裂解缓冲液（1X）在室温下轻轻振荡 30 分钟裂解细胞。

使用补充的 4 号裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，将 16µL 每种稀释液转移至低体积白色微孔板中，然后加入 4µL HTRF 总 BRD3 检测试剂。

使用等量的裂解物进行 HTRF 与蛋白质印迹法的平行比较。

在这些实验条件下，HTRF 总 BRD3 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 2 倍。

HTRF 总 BRD3 检测与蛋白质印迹法的比较

简化通路

BRD3 信号通路
BRD3 与超乙酰化染色质区域（也称为超级增强子区域）结合，并在转录调控中发挥作用。它在染色质上提供一个支架，用于招募 E2F 蛋白等进行染色质重塑。当转录因子 GATA1 被 CREB 结合蛋白（CRB）乙酰化后，BRD3 也会被其招募，以激活和抑制靶基因并促进其染色质占据。

HTRF 总 BRD3 检测信号通路

规格

应用：细胞信号传导
兼容自动化：是
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
兼容的裂解缓冲液：1 号裂解缓冲液、2 号裂解缓冲液、3 号裂解缓冲液、4 号裂解缓冲液
分子修饰：总量
产品类别：试剂盒
样品体积：16µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷蛋白
靶标物种：人
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域：肿瘤学与炎症
单位规格：500 个检测点

没有数据

货号：64BRD3TPEG

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