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HTRF (H/M) BRD9 TOTAL KIT - 500 PTS

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概述

BRD9（含 BRD9 溴结构域蛋白 9）是含溴结构域蛋白家族 IV 的成员，该家族还包括 BRD7。BRD9 是 SWI/SNF（GBAF 或 ncBAF）复合体的亚基，可结合组蛋白的乙酰化赖氨酸残基，介导染色质重塑和转录调控。BRD9 参与多能性调节和细胞发育。

BRD9 过表达与神经发育障碍以及急性髓系白血病等癌症相关。最近，通过 PROTAC 分子靶向 BRD9 降解已成为一种新颖且有前

景的治疗方法。然而，BRD9 和 BRD7 蛋白有 72% 的氨基酸残基相似性，因此化合物很可能同时靶向原癌基因 BRD9 和抑癌基因 BRD7。因此，必须仔细研究靶向 BRD9 或 BRD7 的化合物的选择性。为此，HTRF 总 BRD7 检测试剂盒是 HTRF 总 BRD9 检测试剂盒的重要配套检测工具，可实现可靠的化合物分析。

工作原理

总 BRD9 检测原理

HTRF 总 BRD9 检测可定量细胞裂解物中 BRD9 的表达水平。与蛋白质印迹法不同，该检测完全基于微孔板，无需凝胶、电泳或转膜步骤。总 BRD4 检测使用两种标记抗体：一种与供体荧光团偶联，另一种与受体荧光团偶联。两种抗体都对该蛋白上的特定表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在 BRD9 时，添加这些偶联物会使供体荧光团与受体荧光团接近，从而产生 FRET 信号。其强度与样品中蛋白质的浓度直接成正比，并为在无需洗涤的检测格式下评估蛋白质表达提供了一种方法。

HTRF 总 BRD9 检测原理

总 BRD9 双板检测方案

双板方案包括先在 96 孔板中培养细胞，然后裂解细胞，再将裂解物转移到 384 孔小体积检测板中，之后添加总 BRD9 HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

HTRF 总 BRD9 双板检测方案

总 BRD9 单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测总 BRD9 可在单个用于培养、刺激和裂解的板中进行。无需洗涤步骤。这种高通量筛选设计的方案能够实现微型化，同时保持稳定的 HTRF 质量。

HTRF 总 BRD9 单板检测方案

检测验证

在多种人和小鼠细胞系上的验证

将贴壁人细胞系 MCF7 和 MDA-MB-543 细胞（乳腺）、HELA（宫颈）、SH-SY5Y（骨髓神经母细胞）以及小鼠细胞系 NIH3T3 和 Neuro2A 以 100,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔培养板中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时。移除培养基后，用 50µL 补充的 4 号裂解缓冲液（1X）裂解细胞。

将悬浮免疫人 PL-21 细胞系（急性髓系白血病）以 100,000 个细胞 / 孔的密度、30µL / 孔的量接种到 96 孔板中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 1 小时，然后用 10µL 补充的 4 号裂解缓冲液（4X）裂解。

使用 HTRF 总 BRD9 试剂盒评估 BRD9 的表达水平。简要步骤为：将 16µL 细胞裂解物转移到低体积白色微孔板中，然后加入 4µL 预混合的 HTRF 检测试剂。室温过夜孵育后记录 HTRF 信号。虚线对应非特异性 HTRF 信号。值得注意的是，预先对细胞密度进行了优化，以确保 HTRF 检测处于试剂盒的动态范围内（数据未显示）。

HTRF 总 BRD9 检测能有效检测多种表达不同水平该蛋白的细胞模型中的 BRD9。

总 BRD9 检测在多种细胞系上的验证

PROTAC® 诱导的 BRD9 降解

human-total-BRD9-detection-kit-5.svg（人总 BRD9 检测试剂盒 - 5 示意图）

MCF7 细胞上总 BRD9 检测的药理学验证 ——GAPDH

HeLa 细胞上总 BRD9 检测的药理学验证 ——PROTAC

HeLa 细胞上总 BRD9 检测的药理学验证 ——GAPDH

将 MCF7 和 HeLa 细胞以 50,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔板中，在 37°C、5% CO₂条件下培养 24 小时。移除细胞培养基后，用浓度递增的一系列 PROTAC 化合物处理细胞：dBRD9 和 VZ185，以及作为阴性无关对照的 PROTAC ARV-471（PROTAC 雌激素受体）。过夜孵育后，移除细胞培养基，向每个孔中加入 50µL 补充的 4 号裂解缓冲液（1X）。细胞裂解后，将 16µL 裂解物转移至 384 孔低体积白色微孔板中，加入 4µL HTRF BRD9 检测抗体。过夜孵育后记录 HTRF 信号。

在这两种细胞类型中，两种 BRD9 PROTAC 降解剂均能触发 BRD9 蛋白呈剂量依赖性减少，而在 ARV-471 对照条件下，BRD9 的表达水平以及 GAPDH 均保持稳定。这些结果表明 PROTAC 可诱导特异性 BRD9 降解，其 DC50 * 在纳摩尔范围内，与预期一致（Remillard 等人，《德国应用化学国际版》，2017 年；Zoppi 等人，《药物化学杂志》，2019 年）

DC50 指降解剂使 50% 的靶蛋白发生降解时的浓度。

PROTAC 对 BRD9 与 BRD7 的靶向分析

BRD9 与 BRD7 的靶向分析 —— 总 BRD9 检测

BRD9 与 BRD7 的靶向分析 —— 总 BRD7 检测

PROTAC®	相关描述	弹头	E3 连接酶配体	DC50（纳摩尔）
	蛋白靶标			总 BRD9	总 BRD7
dBRD9	BRD9	BI7273	泊马度胺（ cereblon 配体）	87	无降解
VZ185	BRD7 和 BRD9	BI7273	VH101（VHL 配体）	99	87

由于 BRD9 是一种癌基因，而 BRD7 发挥抑癌作用，因此选择性降解 BRD9 而非 BRD7 具有重要意义。

将 HeLa 细胞以 50,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔板中，在 37°C、5% CO₂条件下培养 24 小时。移除细胞培养基后，用浓度递增的 dBRD9 和 VZ185 PROTAC 化合物处理细胞。过夜处理后，移除细胞培养基，向每个孔中加入 50µL 补充的 4 号裂解缓冲液（1X）。细胞裂解后，将 16µL 裂解物转移至 384 孔低体积白色微孔板中，使用总 BRD9 或总 BRD7 检测试剂加入 4µL HTRF 检测抗体。过夜孵育后记录 HTRF 信号。

这些结果表明，VZ185 可诱导 BRD9 和 BRD7 呈剂量依赖性减少，而 dBRD9 仅诱导 BRD9 呈剂量依赖性减少。在相同条件下，GAPDH 保持稳定（数据未显示）。这一结果证实了 dBRD9 可介导选择性 BRD9 降解，如 Remillard 等人（《德国应用化学国际版》，2017 年）和 Zoppi 等人（《药物化学杂志》，2019 年）所描述。

使用敲除 HAP1 细胞系验证 HTRF 总 BRD9 检测的特异性

使用 HTRF 总 BRD9 试剂盒评估 HAP1 细胞（野生型）和五种敲除了 BRD9、BRD7（家族 IV）、BRD2、BRD3 或 BRD4（BET 家族）的 HAP1 不同细胞系中 BRD9 的表达水平。预先对细胞密度进行了优化，以确保 HTRF 检测处于试剂盒的动态范围内（数据未显示）。

将这 6 种不同的细胞系以 50,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔板中，在 37°C、5% CO₂条件下培养 24 小时。移除培养基后，用 50µL 补充的 4 号裂解缓冲液（1X）裂解细胞，然后将 16µL 细胞裂解物转移至低体积白色微孔板中，随后加入 4µL 预混合的检测试剂。室温过夜孵育后记录 HTRF 信号。

在 HAP1 BRD9 敲除细胞中，HTRF 信号与非特异性信号（虚线）相当，表明 BRD9 基因被完全沉默，而正如预期的那样，在其他细胞系中可很好地检测到 BRD9 水平。

值得注意的是：i）在 HAP1 BRD3 敲除细胞系中，BRD9 的表达水平显著更高，这表明可能存在代偿机制；ii）在野生型和 BRD7 敲除细胞系中，BRD9 的表达水平相似，这证实了 HTRF BRD9 试剂盒相对于 BRD7 的选择性，尽管这两种蛋白质具有超过 50% 的序列同源性。

目录细胞系参考（Horizon Discovery）：HAP1 野生型 #C631；HAP1 BRD9 敲除 #HZGHC000934c003；HAP1 BRD7 敲除 #HZGHC000923c010；HAP1 BRD2 敲除 #HZGHC000356c015；HAP1 BRD3 敲除 #HZGHC000244c004；HAP1 BRD4 敲除 #HZGHC000937c007。

使用敲除 HAP1 细胞系验证总 BRD9 检测的特异性

HTRF 总 BRD9 检测与蛋白质印迹法的比较

将 MCF7 细胞在 T175 培养瓶中的完全培养基中于 37°C、5% CO₂条件下培养。孵育 48 小时后，移除细胞培养基，用 3mL 补充的 4 号裂解缓冲液（1X）在室温下轻轻振荡 30 分钟以裂解细胞。

使用补充的 4 号裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，将 16µL 每种稀释液转移至低体积白色微孔板中，然后加入 4µL HTRF 总 BRD9 检测试剂。

使用等量的裂解物对 HTRF 检测与蛋白质印迹法进行平行比较。

在这些实验条件下，HTRF 总 BRD9 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 8 倍。

HTRF 总 BRD9 检测与蛋白质印迹法的比较

dBRD9 PROTAC 在 HTRF 和蛋白质印迹法中的药理学研究

将 MCF7 细胞以 50,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔板中，在 37°C、5% CO₂条件下培养 24 小时。移除细胞培养基后，用浓度递增的 dBRD9 处理细胞。过夜处理后，移除细胞培养基，向每个孔中加入 50µL 补充的 4 号裂解缓冲液（1X）。使用 16µL 相同的细胞裂解物，按照各自的方案进行总 HTRF BRD9 检测和蛋白质印迹检测。

两种技术均显示 dBRD9 可诱导 BRD9 呈剂量依赖性减少，且 DC50 具有相关性（HTRF 为 40 纳摩尔，蛋白质印迹法为 90 纳摩尔），而 GAPDH 的表达水平保持稳定（数据未显示）。

dBRD9 PROTAC 在 HTRF 和蛋白质印迹法中的药理学研究

两种技术均显示 dBRD9 可诱导 BRD9 呈剂量依赖性减少，且 DC50 具有相关性，而 GAPDH 的表达水平保持稳定（数据未显示）。

简化通路

BRD9 信号通路

BRD9 是 GBAF（或 ncBAF）重塑复合体的亚基，专门与 GLTSCR1/1L 蛋白相关联。BRD9 结合乙酰化组蛋白，导致染色质重塑和基因转录调控，例如 cMyc（凋亡调节因子）和 SOCS3（STAT5 通路调节因子）（1,2）。

最近的研究表明，BRD9 的表达受 KRAS 和 PI3K 通路调控（2）。BRD4 以依赖溴结构域的方式介导 GBAF 复合体亚基向染色质的募集（1,3）。

此外，已有报道称 BRD9 作为转录激活因子，在干扰素刺激基因（ISGs）的 IRF9 依赖性高效表达中发挥关键作用，这也涉及 STAT2 和 STAT1 蛋白（4）。

（1）：Innis 等人，《表观遗传学与染色质》，2020 年

（2）：Zhu 等人，《肿瘤靶点与治疗》，2020 年

（3）：Gatchalian 等人，2018 年

（4）：Borold 等人，《欧洲分子生物学组织报告》，2021 年

pathway-BRD9-total.svg（BRD9 总检测信号通路图）

规格

应用：细胞信号传导
兼容自动化：是
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
兼容的裂解缓冲液：1 号裂解缓冲液、2 号裂解缓冲液、3 号裂解缓冲液、4 号裂解缓冲液
分子修饰：总量
产品类别：试剂盒
样品体积：16µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷蛋白
靶标物种：人、小鼠
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域：肿瘤学与炎症
单位规格：500 个检测点

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