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HTRF (H) TFEB P-S211 KIT - 10K PTS

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概述
TFEB 是巨自噬的上游调节因子，而巨自噬是维持细胞内稳态的一种生理过程。这使得 TFEB 成为多种疾病（与衰老相关的疾病、感染性疾病、溶酶体贮积症、神经退行性疾病或癌症）的新型治疗靶点。

工作原理
磷酸化 TFEB（Ser211）检测原理
磷酸化 TFEB（Ser211）检测可对 Ser211 位点磷酸化的 TFEB 进行定量。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测完全基于微孔板开展，无需凝胶、电泳或转膜操作。检测过程中使用两种抗体，一种标记有供体荧光团，另一种标记有受体荧光团。第一种抗体经筛选，能够特异性结合蛋白质上的磷酸化基序；第二种抗体则可不依赖蛋白质的磷酸化状态对其进行识别。蛋白质发生磷酸化时，会形成包含这两种标记抗体的免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团相互靠近，进而产生荧光共振能量转移（FRET）信号。该信号的强度与样品中磷酸化蛋白的浓度直接相关，且在无需洗涤的检测模式下，即可实现对蛋白质磷酸化状态的评估。

磷酸化 TFEB（Ser211）双板检测方案
双板方案的流程为：先在 96 孔板中培养细胞，然后进行裂解，接着将裂解物转移至 384 孔低体积检测板，最后加入磷酸化 TFEB（Ser211）HTRF 检测试剂。此方案能够对细胞活力和汇合度进行监测。

磷酸化 TFEB（Ser211）单板检测方案
使用 HTRF 试剂检测磷酸化 TFEB（Ser211）时，可在同一微孔板内完成细胞培养、刺激和裂解操作，无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案，在实现实验微型化的同时，还能保持稳定可靠的 HTRF 检测质量。

检测验证
使用 mTOR 抑制剂抑制 TFEB Ser211 磷酸化
将 HeLa 细胞以每孔 100,000 个细胞的密度接种到经培养处理的 96 孔板中，采用完全培养基培养，并在 37°C、5% CO₂ 条件下过夜孵育。随后，用浓度递增的 mTOR 抑制剂（AZD2014 或 PP242）处理细胞，在 37°C、5% CO₂ 环境中孵育 1 小时。用 50 µL 补充的 #4 裂解缓冲液裂解细胞后，取 16 µL 裂解物转移至 384 孔低体积白色微孔板中，再加入 4 µL HTRF 磷酸化 TFEB（S211）检测抗体。过夜孵育后，记录 HTRF 信号。

结果如预期所示，经 mTOR 抑制剂处理后，Ser211 位点磷酸化的 TFEB 呈剂量依赖性减少，而 TFEB 的总表达水平未受到显著影响。此外，在相同实验条件下，通过 ATPlite™ 检测（Revvity 公司，货号 #601673）未观察到细胞毒性效应（数据未展示）。

通过 siRNA 评估磷酸化 TFEB（Ser211）试剂盒的特异性
将 HeLa 细胞接种到 96 孔板中（每孔 20,000 个细胞），培养 24 小时。之后，用 TFEB 特异性 siRNA 以及阴性对照 siRNA 对细胞进行转染。孵育 48 小时后，裂解细胞，取 16 µL 裂解物转移至 384 孔低体积白色微孔板中，再加入 4 µL HTRF 磷酸化 TFEB（S211）检测抗体。

与转染阴性对照 siRNA 的细胞相比，转染 TFEB siRNA 的细胞其信号降低了 90%。在相同实验条件下，通过 ATPlite™ 检测发现，TFEB 的沉默对细胞增殖或活力无影响。

这些结果证实了 HTRF 磷酸化 TFEB（S211）试剂盒的检测特异性。

不同人类细胞系中磷酸化 TFEB（Ser211）的检测
使用 HTRF 磷酸化 TFEB（Ser211）试剂盒对不同细胞系（THP1、HeLa、HEK293T 和 U87-MG）中磷酸化 TFEB（Ser211）的表达水平进行了评估。

这些细胞系在 T175 培养瓶中用完全培养基培养，置于 37°C、5% CO₂ 环境中。孵育 48 小时后，用 3 mL 补充的 #4 裂解缓冲液（1X）在室温下轻轻振荡，裂解细胞 30 分钟。取 16 µL 各裂解物转移至低体积白色微孔板中，再加入 4 µL HTRF 磷酸化 TFEB（Ser211）检测试剂。

HTRF 磷酸化 TFEB（S211）检测与蛋白质印迹法的比较
将 THP1 细胞在 T175 培养瓶中用完全培养基培养，置于 37°C、5% CO₂ 环境中。孵育 48 小时后，用 3 mL 补充的 #4 裂解缓冲液（1X）在室温下轻轻振荡，裂解细胞 30 分钟。

用补充的裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，取 16 µL 各稀释液转移至低体积白色微孔板中，再加入 4 µL HTRF 磷酸化 TFEB（S211）检测试剂。取等量裂解物，用于 HTRF 检测与蛋白质印迹法的平行比较。

在此条件下，HTRF 磷酸化 TFEB（S211）检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 8 倍。

简化通路
TFEB 信号通路
TFEB（转录因子 EB）是属于 MiTF/TFE 家族的一种转录因子。TFEB 通过 96 个以上溶酶体基因启动子中存在的共有序列（CLEAR 基序 —— 溶酶体协同表达与调控基序），诱导与自噬和溶酶体生物发生相关的蛋白质编码基因的转录。

TFEB 的活性受多种激酶（包括 AKT、mTOR 和 ERK2）介导的磷酸化事件调控。

在营养丰富的条件下，TFEB 在 Ser211 位点被 mTOR 磷酸化，并被隔离在细胞质中；而在饥饿或溶酶体功能异常时，TFEB 发生去磷酸化并转运至细胞核，从而促进基因转录。

TFEB 作为巨自噬的上游调节因子，而巨自噬是维持细胞内稳态的生理过程。这使得 TFEB 成为多种疾病（与衰老相关的疾病、感染性疾病、溶酶体贮积症、神经退行性疾病或癌症）的新型治疗靶点。

规格
其他规格
应用领域：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
兼容裂解缓冲液：裂解缓冲液 3、裂解缓冲液 4
分子修饰：磷酸化
产品类别：试剂盒
样品体积：16 µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷蛋白
靶标物种：人类
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
单位规格：10,000 次检测点

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货号：64TFEBS2PEH

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