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当前位置:首页 > 产品中心 > Revvity 均相检测试剂 > HTRF (H) TFEB TOTAL KIT - 500 PTS

概述


TFEB 作为大自噬的上游调节因子,大自噬是一种维持细胞内稳态的生理过程。这使 TFEB 成为多种疾病(与衰老相关的疾病、感染性疾病、溶酶体贮积症、神经退行性疾病或癌症)的新治疗靶点。


工作原理


总 TFEB 检测原理
用于定量 TFEB 表达水平的 HTRF 总 TFEB 检测完全基于微孔板,无需凝胶、电泳或转膜步骤。该检测使用两种抗体,一种与供体荧光团偶联,另一种与受体荧光团偶联。这两种抗体对蛋白质上的不同表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在 TFEB 时,添加这些偶联物会使供体荧光团与受体荧光团接近,从而产生 FRET 信号。其强度与样品中蛋白质的浓度直接成正比,并提供了一种在无需洗涤的检测形式下评估蛋白质表达的方法。


总 TFEB 检测原理
总 TFEB 双板检测方案
双板方案包括在裂解前将细胞培养在 96 孔板中,然后在添加总 TFEB HTRF 检测试剂前将裂解物转移到 384 孔小体积检测板中。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。


检测方案


总 TFEB 单板检测方案
使用 HTRF 试剂检测总 TFEB 可在单个用于培养、刺激和裂解的板中进行。无需洗涤步骤。这种为高通量筛选(HTS)设计的方案能够实现小型化,同时保持稳定的 HTRF 质量。


总 TFEB 检测方案 64


检测验证


使用 mTOR 抑制剂抑制 TFEB Ser211 磷酸化过程中对总 TFEB 的监测
将 HeLa 细胞以 100,000 个细胞 / 孔的密度接种在 96 孔培养处理板中,使用完全培养基,在 37°C、5% CO₂条件下过夜孵育。然后,用浓度递增的 mTOR 抑制剂(AZD2014 或 PP242)在 37°C、5% CO₂条件下处理细胞 1 小时。用 50 µL 补充的裂解缓冲液 #4 裂解细胞后,将 16 µL 裂解物转移到 384 孔小体积白色微孔板中,然后添加 4 µL HTRF 总 TFEB 检测抗体。过夜孵育后记录 HTRF 信号。


正如预期的那样,我们的结果显示,mTOR 抑制剂处理后,Ser211 上的磷酸化 TFEB 呈剂量依赖性降低,而总 TFEB 表达水平没有显著变化。此外,在相同实验条件下,通过 ATPlite™检测(Revvity,#601673)未观察到细胞毒性作用(数据未显示)。


总 TFEB 抑制剂检测验证
总 TFEB 抑制剂检测验证


通过 siRNA 评估总 TFEB 试剂盒的特异性
将 HeLa 细胞接种在 96 孔板中(20,000 个细胞 / 孔),培养 24 小时。然后,用针对 TFEB 的特异性 siRNA 以及阴性对照 siRNA 转染细胞。孵育 48 小时后,裂解细胞,将 16 µL 裂解物转移到 384 孔小体积白色微孔板中,然后添加 4 µL HTRF 总 TFEB 检测抗体。


与转染阴性 siRNA 的细胞相比,TFEB siRNA 使信号降低了 90%。在相同实验条件下,当用 ATPlite™检测评估时,TFEB 的沉默对细胞增殖或活力没有影响。


这些结果证明了 HTRF 总 TFEB 试剂盒的检测特异性。


总 TFEB 检测特异性验证
总 TFEB 检测特异性验证


在各种人类细胞系中检测总 TFEB
使用 HTRF 总 TFEB 试剂盒在不同细胞系(THP1、HeLa、HEK293T 和 U87-MG)中评估总 TFEB 表达水平。


这些细胞系在 T175 培养瓶中,使用完全培养基,在 37°C、5% CO₂条件下培养。孵育 48 小时后,用 3 mL 补充的裂解缓冲液 #4(1X)在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。将 16 µL 每种裂解物转移到小体积白色微孔板中,然后添加 4 µL HTRF 总 TFEB 检测试剂。


总 TFEB 多功能性验证


HTRF 总 TFEB 检测与蛋白质印迹法的比较
THP1 细胞在 T175 培养瓶中,使用完全培养基,在 37°C、5% CO₂条件下培养。孵育 48 小时后,用 3 mL 补充的裂解缓冲液 #4(1X)在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。


使用补充的裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释,将 16 µL 每种稀释液转移到小体积白色微孔板中,然后添加 4 µL HTRF 总 TFEB 检测试剂。使用等量的裂解物进行 HTRF 和蛋白质印迹法的平行比较。


在这些条件下,HTRF 总 TFEB 检测的灵敏度是蛋白质印迹技术的 16 倍。


总 TFEB 与蛋白质印迹比较验证


简化通路


TFEB 信号通路
TFEB(转录因子 EB)是一种属于 MiTF/TFE 家族的转录因子。TFEB 通过在 96 多个溶酶体基因启动子中存在的共有序列(CLEAR 基序 —— 协调溶酶体表达和调控)诱导编码与自噬和溶酶体生物发生相关蛋白质的基因转录。


TFEB 的活性由不同激酶(包括 AKT、mTOR 和 ERK2)介导的磷酸化事件控制。


在营养丰富的条件下,TFEB 在 Ser 211 位点被 mTOR 磷酸化,并被隔离在细胞质中;而在饥饿或溶酶体功能障碍时,TFEB 去磷酸化并转运到细胞核中以促进基因转录。


TFEB 作为大自噬的上游调节因子,大自噬是一种维持细胞内稳态的生理过程。这使 TFEB 成为多种疾病(与衰老相关的疾病、感染性疾病、溶酶体贮积症、神经退行性疾病或癌症)的新治疗靶点。


总 TFEB 简化通路


规格


其他规格
应用
细胞信号传导
品牌
HTRF
检测方式
HTRF
裂解缓冲液兼容性
裂解缓冲液 1
裂解缓冲液 2
裂解缓冲液 3
裂解缓冲液 4
分子修饰
总(蛋白)
产品类别
试剂盒
样品体积
16 µL
运输条件
干冰运输
靶标类别
磷酸化蛋白
靶标物种
人类
技术
时间分辨荧光共振能量转移(TR-FRET)
单位规格
500 个检测点


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