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HTRF UBIQUITIN P-S65KIT - 500 PTS

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概述

磷酸化泛素（Ser65）细胞检测旨在监测泛素链磷酸化形式的水平。泛素本身是一种含 76 个氨基酸的蛋白质（分子量 8.5 kDa），其表达广泛且高度保守，在人类和小鼠中氨基酸序列一致性达 100%。

泛素的磷酸化是通过 Parkin/PINK-1 相互作用实现线粒体质量控制过程中的关键步骤。Parkin 是一种泛素连接酶 E3，可将泛素偶联到受损的线粒体蛋白上，进而导致细胞器降解。PINK1 是一种丝氨酸 / 苏氨酸激酶，仅在受损的线粒体上积累，并可磷酸化两种底物，即 Parkin 的泛素样结构域和泛素链。

经放大的、依赖 Parkin/PINK-1 的泛素功能可作为受损线粒体（线粒体自噬）的隔离和降解信号。该信号通路的失调与某些形式的帕金森病相关。

解偶联剂（如 CCCP 和缬氨霉素）导致的线粒体去极化，会使 PINK1 在线粒体外膜上积累，并触发 Ser65 磷酸化泛素的产生。

工作原理

磷酸化泛素（Ser65）检测原理

磷酸化泛素（Ser65）检测用于测量在 Ser65 位点发生磷酸化的泛素。与蛋白质印迹法不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。检测中使用两种抗体，一种标记有供体荧光团，另一种标记有受体荧光团。第一种抗体经筛选可特异性结合蛋白质上的磷酸化基序，第二种抗体则能够不依赖蛋白质的磷酸化状态识别该蛋白质。蛋白质磷酸化会促使形成包含两种标记抗体的免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团接近，从而产生 FRET 信号。信号强度与样品中磷酸化蛋白质的浓度直接成正比，且该检测采用 “无需洗涤” 的形式，为评估蛋白质的磷酸化状态提供了便利。

磷酸化泛素（Ser65）双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，然后裂解细胞，再将裂解物转移到 384 孔小体积检测板中，之后加入激活缓冲液，再加入磷酸化泛素（Ser65）HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞活力和汇合度。

磷酸化泛素（Ser65）单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测磷酸化泛素（Ser65）可在单个培养板中完成，该培养板同时用于细胞培养、刺激和裂解，无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案支持实验微型化，同时保持稳定的 HTRF 检测质量。

检测验证

人神经细胞系的 CCCP 刺激曲线

将神经母细胞瘤（人）细胞接种到 96 孔板中（200,000 个细胞 / 孔），在完全培养基中于 37°C、5% CO₂条件下培养过夜。

次日，更换培养基，用不同浓度的线粒体解偶联剂 —— 羰基氰化物间氯苯腙（CCCP）在 37°C、5% CO₂条件下孵育细胞 6 小时。移除培养基后，加入 50µL 1X 补充的 #1 裂解缓冲液，在室温下轻轻振荡 30 分钟裂解细胞，将 14µL 裂解物转移到小体积白色微孔板中，随后加入 2µL 激活缓冲液和 4µL HTRF 泛素磷酸化 - S65 检测抗体。

同时，对 1/4 稀释的裂解物取 4µL 进行 HTRF 微管蛋白检测，作为标准化工具。室温孵育过夜后记录 HTRF 信号。

在神经细胞中，CCCP 可促进泛素在 Ser65 位点的磷酸化，其 EC50 值与报道值一致。微管蛋白检测表明，在此浓度范围内不存在 CCCP 毒性问题。

小鼠 Neuro-2A 细胞系的 CCCP 刺激曲线

将 Neuro-2A（小鼠）细胞接种到 96 孔板中（200,000 个细胞 / 孔），按照上述神经细胞的处理方法用 CCCP 刺激。然后将 14µL 裂解物转移到小体积白色微孔板中，随后加入 2µL 激活缓冲液和 4µL HTRF 泛素磷酸化 - S65 检测抗体。同时，对未稀释的裂解物取 4µL 进行 HTRF 微管蛋白检测。

室温孵育过夜后记录 HTRF 信号。

在 Neuro-2A 细胞中，CCCP 可促进泛素在 Ser65 位点的磷酸化，其 EC50 值处于微摩尔范围，与在神经细胞中观察到的值相近。

人神经细胞系的缬氨霉素刺激曲线

将神经（人）细胞接种到 96 孔板中（200,000 个细胞 / 孔），在完全培养基中于 37°C、5% CO₂条件下培养过夜。

次日，更换培养基，用不同浓度的线粒体解偶联剂 —— 缬氨霉素在 37°C、5% CO₂条件下孵育细胞 4 小时。移除培养基后，加入 50µL 1X 补充的 #1 裂解缓冲液，在室温下轻轻振荡 30 分钟裂解细胞，将 14µL 裂解物转移到小体积白色微孔板中，随后加入 2µL 激活缓冲液和 4µL HTRF 泛素磷酸化 - S65 检测抗体。室温孵育过夜后记录 HTRF 信号。在神经细胞中，缬氨霉素可促进泛素在 Ser65 位点的磷酸化，其 EC50 值处于纳摩尔范围。

HTRF 磷酸化泛素（Ser65）检测与蛋白质印迹法的比较

将人神经细胞接种到 T175 培养瓶的完全培养基中，用 10µM CCCP 在 37°C、5% CO₂条件下孵育 6 小时。然后加入 3mL 补充的 #1 裂解缓冲液，在室温下轻轻振荡 30 分钟裂解细胞。离心 10 分钟后收集可溶性上清液。用补充的裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，将 14µL 各稀释液转移到 384 孔小体积白色微孔板中，随后加入 2µL 激活缓冲液和 4µL HTRF 泛素磷酸化 - S65 检测试剂。使用等量的裂解物进行蛋白质印迹法与 HTRF 检测的平行比较。

结果表明，至少在该实验条件下，HTRF 泛素磷酸化 - S65 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 4 倍。

简化通路

在去极化诱导的线粒体自噬过程中，与线粒体外膜相连的 PINK1（PTEN 诱导激酶 1）通过二聚化和自磷酸化被激活。激活后，PINK-1 会在 Parkin（一种泛素连接酶）的泛素样结构域的 Ser65 位点对其进行磷酸化。PINK-1 还会在线粒体外膜蛋白所连接的多聚泛素链的 Ser65 位点对其进行磷酸化。由此产生的 Ser65 磷酸化泛素作为关键信号，招募线粒体蛋白以启动线粒体自噬。

规格参数

项目	详情
应用领域	细胞信号传导
品牌	HTRF
检测方式	HTRF（均相时间分辨荧光）
兼容的裂解缓冲液	裂解缓冲液 1、裂解缓冲液 3、裂解缓冲液 4、裂解缓冲液 5
分子修饰	磷酸化
产品类别	试剂盒
样品体积	16µL
运输条件	干冰运输
靶标类别	磷酸化蛋白
靶标物种	人、小鼠
技术原理	TR-FRET（时间分辨荧光共振能量转移）
治疗领域	神经科学
单位规格	500 个检测点

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货号：64UBIS65PEG

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