HTRF UBIQUITIN P-S65KIT - 10K PTS

概述

磷酸化泛素（Ser65）细胞检测旨在监测泛素链磷酸化形式的水平。泛素本身是一种含76个氨基酸的蛋白质（分子量8.5 kDa），其表达广泛且高度保守，在人类和小鼠中氨基酸序列一致性达100%。 泛素的磷酸化是通过Parkin/PINK-1相互作用实现线粒体质量控制过程中的关键步骤。Parkin是一种泛素连接酶E3，可将泛素偶联到受损的线粒体蛋白上，进而导致细胞器降解。PINK1是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，仅在受损的线粒体上积累，并可磷酸化两种底物，即Parkin的泛素样结构域和泛素链。 经放大的、依赖Parkin/PINK-1的泛素功能可作为受损线粒体（线粒体自噬）的隔离和降解信号。该信号通路的失调与某些形式的帕金森病相关。 解偶联剂（如CCCP和缬氨霉素）导致的线粒体去极化，会使PINK1在线粒体外膜上积累，并触发Ser65磷酸化泛素的产生。 工作原理

磷酸化泛素（Ser65）检测原理 磷酸化泛素（Ser65）检测用于测量在Ser65位点发生磷酸化的泛素。与蛋白质印迹法不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。检测中使用两种抗体，一种标记有供体荧光团，另一种标记有受体荧光团。第一种抗体经筛选可特异性结合蛋白质上的磷酸化基序，第二种抗体则能够不依赖蛋白质的磷酸化状态识别该蛋白质。蛋白质磷酸化会促使形成包含两种标记抗体的免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团接近，从而产生FRET信号。信号强度与样品中磷酸化蛋白质的浓度直接成正比，且该检测采用“无需洗涤”的形式，为评估蛋白质的磷酸化状态提供了便利。 磷酸化泛素（Ser65）双板检测方案 双板方案包括：先在96孔板中培养细胞，然后裂解细胞，再将裂解物转移到384孔小体积检测板中，之后加入激活缓冲液，再加入磷酸化泛素（Ser65）HTRF检测试剂。该方案能够监测细胞活力和汇合度。 磷酸化泛素（Ser65）单板检测方案 使用HTRF试剂检测磷酸化泛素（Ser65）可在单个培养板中完成，该培养板同时用于细胞培养、刺激和裂解，无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案支持实验微型化，同时保持稳定的HTRF检测质量。 检测验证

人神经细胞系的CCCP刺激曲线 将神经母细胞瘤（人）细胞接种到96孔板中（200,000个细胞/孔），在完全培养基中于37°C、5%CO₂条件下培养过夜。 次日，更换培养基，用浓度递增的线粒体解偶联剂——羰基氰化物间氯苯腙（CCCP）在37°C、5%CO₂条件下孵育细胞6小时。移除培养基后，加入50µL 1X补充的#1裂解缓冲液，在室温下轻轻振荡30分钟裂解细胞，将14µL裂解物转移到小体积白色微孔板中，随后加入2µL激活缓冲液和4µL HTRF泛素磷酸化-S65检测抗体。 同时，对1/4稀释的裂解物取4µL进行HTRF微管蛋白检测，作为标准化工具。室温孵育过夜后记录HTRF信号。 在神经细胞中，CCCP可促进泛素在Ser65位点的磷酸化，其EC50值与报道值一致。微管蛋白检测表明，在此浓度范围内不存在CCCP毒性问题。 小鼠Neuro-2A细胞系的CCCP刺激曲线 将Neuro-2A（小鼠）细胞接种到96孔板中（200,000个细胞/孔），按照上述神经细胞的处理方法用CCCP刺激。然后将14µL裂解物转移到小体积白色微孔板中，随后加入2µL激活缓冲液和4µL HTRF泛素磷酸化-S65检测抗体。同时，对未稀释的裂解物取4µL进行HTRF微管蛋白检测。 室温孵育过夜后记录HTRF信号。 在Neuro-2A细胞中，CCCP可促进泛素在Ser65位点的磷酸化，其EC50值处于微摩尔范围，与在神经细胞中观察到的值相近。 人神经细胞系的缬氨霉素刺激曲线 将神经（人）细胞接种到96孔板中（200,000个细胞/孔），在完全培养基中于37°C、5%CO₂条件下培养过夜。 次日，更换培养基，用浓度递增的线粒体解偶联剂——缬氨霉素在37°C、5%CO₂条件下孵育细胞4小时。移除培养基后，加入50µL 1X补充的#1裂解缓冲液，在室温下轻轻振荡30分钟裂解细胞，将14µL裂解物转移到小体积白色微孔板中，随后加入2µL激活缓冲液和4µL HTRF泛素磷酸化-S65检测抗体。室温孵育过夜后记录HTRF信号。在神经细胞中，缬氨霉素可促进泛素在Ser65位点的磷酸化，其EC50值处于纳摩尔范围。 HTRF磷酸化泛素（Ser65）检测与蛋白质印迹法的比较 将人神经细胞接种到T175培养瓶的完全培养基中，用10µM CCCP在37°C、5%CO₂条件下孵育6小时。然后加入3mL补充的#1裂解缓冲液，在室温下轻轻振荡30分钟裂解细胞。离心10分钟后收集可溶性上清液。用补充的裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，将14µL各稀释液转移到384孔小体积白色微孔板中，随后加入2µL激活缓冲液和4µL HTRF泛素磷酸化-S65检测试剂。使用等量的裂解物进行蛋白质印迹法与HTRF检测的平行比较。 结果表明，至少在该实验条件下，HTRF泛素磷酸化-S65检测的灵敏度是蛋白质印迹法的4倍。简化通路

在去极化诱导的线粒体自噬过程中，与线粒体外膜相连的PINK1（PTEN诱导激酶1）通过二聚化和自磷酸化被激活。激活后，PINK-1会在Parkin（一种泛素连接酶）的泛素样结构域的Ser65位点对其进行磷酸化。PINK-1还会在线粒体外膜蛋白所连接的多聚泛素链的Ser65位点对其进行磷酸化。由此产生的Ser65磷酸化泛素作为关键信号，招募线粒体蛋白以启动线粒体自噬。 规格参数

其他规格 - 应用领域：细胞信号传导 - 品牌：HTRF - 检测方式：HTRF - 兼容的裂解缓冲液：裂解缓冲液1、裂解缓冲液3、裂解缓冲液4、裂解缓冲液5 - 分子修饰：磷酸化 - 产品类别：试剂盒 - 样品体积：16µL - 运输条件：干冰运输 - 靶标类别：磷酸化蛋白 - 靶标物种：人、小鼠 - 技术原理：TR-FRET - 治疗领域：神经科学 - 单位规格：10,000个检测点