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HTRF (H) ULK1 P-S556 KIT - 500 PTS

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概述

ULK1 是一种胞质激酶，是复合物的一部分，作为巨自噬的上游调节因子，可促进吞噬泡的形成。自噬是维持细胞内稳态的生理过程，这使得 ULK1 成为多种疾病（与衰老相关的疾病、传染病、溶酶体贮积症、神经退行性疾病或癌症）的新治疗靶点。

工作原理

HTRF 磷酸化 ULK1（Ser556）检测原理

磷酸化 ULK1（Ser556）检测用于测量在 Ser556 位点发生磷酸化的 ULK1。与蛋白质印迹法不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。检测中使用两种抗体，一种标记有供体荧光团，另一种标记有受体荧光团。第一种抗体经筛选可特异性结合蛋白质上的磷酸化基序，第二种抗体则能够不依赖蛋白质的磷酸化状态识别该蛋白质。蛋白质磷酸化会促使形成包含两种标记抗体的免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团接近，从而产生 FRET（荧光共振能量转移）信号。信号强度与样品中磷酸化蛋白质的浓度直接成正比，且该检测采用 “无需洗涤” 的形式，为评估蛋白质的磷酸化状态提供了便利。

磷酸化 ULK1（S556）双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，然后裂解细胞，再将裂解物转移到 384 孔小体积检测板中，最后加入磷酸化 ULK1（Ser556）HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞活力和汇合度。

磷酸化 ULK1（Ser556）单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测磷酸化 ULK1（Ser556）可在单个培养板中完成，该培养板同时用于细胞培养、刺激和裂解，无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案支持实验微型化，同时保持稳定的 HTRF 检测质量。

检测验证

在不同细胞系中使用 AMPK 抑制剂抑制 ULK1 Ser556 磷酸化

将 U-87 MG 或 MCF7 细胞接种到 96 孔培养处理板中，每孔 100,000 个细胞，加入完全培养基，在 37°C、5% CO₂条件下孵育过夜。然后用不同浓度的 AMPK 抑制剂（BAY-3827）处理细胞 1 小时（37°C、5% CO₂）。用 25µL 补充的 #4 裂解缓冲液裂解细胞后，将 16µL 裂解物转移到 384 孔小体积白色微孔板中，随后加入 4µL HTRF 磷酸化（S556）ULK1 检测抗体。室温孵育过夜后记录 HTRF 信号。

正如预期的那样，我们的结果显示，经 AMPK 抑制剂处理后，Ser556 位点磷酸化的 ULK1 呈剂量依赖性减少，而总 ULK1 的表达水平未受到显著调节。此外，在相同实验条件下，使用 GAPDH 管家细胞试剂盒（Revvity®，货号 64GAPDHPEG）未观察到细胞毒性作用（数据未显示）。

磷酸化 S556 ULK1 检测的特异性

使用 HTRF 磷酸化 S556 ULK1 试剂盒在不同的 HAP1 细胞系中评估磷酸化 S556 ULK1 的表达水平。

将 HAP1 野生型（HAP1 WT）和 ULK1 敲除的 HAP1（HAP1 KO ULK1）细胞系在 T175 培养瓶中用完全培养基于 37°C、5% CO₂条件下培养。孵育 48 小时后，对于 30×10⁶个细胞，加入 1mL 补充的 #4 裂解缓冲液（1X），在室温下轻轻振荡 30 分钟裂解细胞。

将 16µL 每种裂解物转移到小体积白色微孔板中，随后加入 4µL HTRF 磷酸化（S556）ULK1 检测试剂。

使用多种人类细胞系的磷酸化 S556 ULK1 检测的通用性

使用 HTRF 磷酸化 S556 ULK1 试剂盒在不同细胞系（U-87 MG、MCF7、HeLa）中评估磷酸化 S556 ULK1 的表达水平。

这些不同的细胞系在 T175 培养瓶中用完全培养基于 37°C、5% CO₂条件下培养。孵育 48 小时后，对于 30×10⁶个细胞，加入 1mL 补充的 #4 裂解缓冲液（1X），在室温下轻轻振荡 30 分钟裂解细胞。

将 16µL 每种裂解物转移到小体积白色微孔板中，随后加入 4µL HTRF 磷酸化 S556 ULK1 检测试剂。

HTRF 磷酸化 S556 ULK1 检测与蛋白质印迹法的比较

将 U-87 MG 细胞在 T175 培养瓶中用完全培养基于 37°C、5% CO₂条件下培养。孵育 48 小时后，对于 30×10⁶个细胞，加入 1mL 补充的 #4 裂解缓冲液（1X），在室温下轻轻振荡 30 分钟裂解细胞。

用补充的裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，将 16µL 各稀释液转移到小体积白色微孔板中，随后加入 4µL HTRF 磷酸化 S556 ULK1 检测试剂。使用等量的裂解物进行 HTRF 检测与蛋白质印迹法的平行比较。

在这些条件下，HTRF 磷酸化 S556 ULK1 检测的灵敏度是蛋白质印迹技术的 8 倍。

简化通路

ULK1 信号通路

ULK1 是一种胞质激酶，是包含 FIP200、Atg101 和 Atg13 的 ULK1 复合物的一部分。ULK 复合物的激活会促进吞噬泡的形成和自噬的启动。

ULK1 复合物受到 mTORC1 的负调控，而 AMPK 介导其激活。mTORC1 通过直接磷酸化 ULK1 上的 Ser758 来抑制 ULK1 复合物。在营养饥饿条件下，AMPK 通过在 Ser317 和 Ser556 位点磷酸化激活 ULK1，或通过抑制 mTORC1 来促进自噬。

ULK1 复合物被认为是自噬的上游枢纽，自噬是维持细胞内稳态的生理过程。这使得 ULK1 成为治疗靶点，特别是在癌症治疗中。例如，ULK1 抑制可诱导非小细胞肺癌（NSCLC）细胞凋亡。

规格参数

项目	详情
应用领域	细胞信号传导
品牌	HTRF
检测方式	HTRF（均相时间分辨荧光）
兼容的裂解缓冲液	裂解缓冲液 1、裂解缓冲液 4
分子修饰	磷酸化
产品类别	试剂盒
样品体积	16µL
运输条件	干冰运输
靶标类别	磷酸化蛋白
靶标物种	人
技术原理	TR-FRET（时间分辨荧光共振能量转移）
单位规格	500 个检测点

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货号：64ULKS5PEG

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