HTRF XIAP BIR3 RED LIGAND

产品概述

HTRF XIAP BIR3 Red配体基于标记的A410099.1衍生物，主要用于开展协同性结合研究。该试剂可在目标蛋白存在的情况下，计算XIAP BIR3 Red配体与XIAP BIR3蛋白的亲和力。通过在目标蛋白缺失和存在两种条件下测定HTRF XIAP BIR3 Red配体与XIAP蛋白的解离常数（Kd），可对使用HTRF XIAP BIR3结合检测试剂盒评估的协同效应进行精确分析。

相较于其他技术，HTRF（均相时间分辨荧光）检测方案具有诸多优势：

• 均相“加样-读取”模式

• 无需洗涤步骤

• 背景信号低

• 可直接从96或384孔微板小型化至384孔低容量及1536孔等高密度检测规格

• 信号稳定，为读取时间或检测规模提供灵活的操作窗口

工作原理

HTRF XIAP配体结合检测原理（针对XIAP BIR3结合结构域）
HTRF XIAP BIR3 Red配体的结合通过直接结合检测模式进行检测，使用抗GST-铽穴状化合物抗体与带有GST标签的人源XIAP BIR3结构域结合。当供体与受体荧光基团足够靠近时，光源（激光或闪光灯）激发供体，触发荧光共振能量转移（FRET）至受体，受体随即在特定波长（665 nm）发射荧光（图A）。特异性结合信号通过从总信号中减去非特异性结合信号计算得出，从而实现对HTRF XIAP BIR3 Red配体的Kd测定（图B）。

HTRF XIAP BIR3 Red配体结合检测方案
HTRF XIAP BIR3 Red配体的饱和结合实验可在384孔板中运行，操作如下：首先分装5 µL稀释液9缓冲液（用于总结合）或XIAP BIR3结合标准品（用于非特异性结合）。随后加入5 µL PROTAC结合缓冲液2（作为参照）或稀释于PROTAC结合缓冲液2中的目标蛋白（用于协同性研究），接着加入5 µL GST标签XIAP BIR3蛋白。最后加入5 µL预混合的HTRF XIAP BIR3 Red配体与抗GST-铽穴状化合物抗体溶液。

室温孵育2小时后，读取HTRF比值。

检测详情

检测验证

在目标蛋白存在条件下XIAP BIR3 Red配体亲和力（Kd）的测定
本例中，评估了在目标蛋白BRD4（10 nM或100 nM）缺失和存在两种条件下，XIAP BIR3 Red配体与GST-XIAP BIR3蛋白的结合亲和力（Kd）。结果表明，BRD4的存在不改变Red配体的Kd值。

因此，该示例表明可以建立由XIAP配体和BRD4弹头组成的PROTAC分子的协同性实验。最终，可通过将PROTAC在二元复合物（XIAP BIR3-PROTAC）中的Ki除以PROTAC在三元复合物（XIAP BIR3-PROTAC-BRD4）中的Ki来计算α因子（协同因子）。

技术规格