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HTRF (H/M) CREBBP TOTAL KIT - 10K PTS

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概述

HTRF 总 CREBBP 细胞检测可便捷且准确地检测细胞内总 CREBBP 的水平。该试剂盒与总 p300 试剂盒的缓冲液兼容，因此同一份裂解物可用于这两个家族成员的分析。

CREBBP（CREB 结合蛋白，也称为 CBP 或 KAT3A）及其同源物 p300（也称为 EP300 或 KAT3B）是关键的转录共激活因子。这些赖氨酸乙酰转移酶（KATs）构成了包含两个成员的 KAT3 家族。它们通过促进转录机制的组装，以及对核心组蛋白和转录共调节因子上的特定赖氨酸残基进行乙酰化，来控制基因转录。CREBBP 和 p300 作为网络 “枢纽”，可与 400 多种蛋白质相互作用，调控控制多种基本细胞过程（如增殖和稳态）的基因表达。

涉及 CREBBP/p300 的突变或染色体易位会导致基因失调，并可能引发多种人类疾病，如癌症、神经退行性疾病和炎症性疾病。近年来，已开发出 CREBBP/p300 PROTAC 降解剂用于治疗人类癌症。

工作原理

总 CREBBP 检测原理

HTRF 总 CREBBP 检测可对细胞裂解物中 CREBBP 的表达水平进行定量。与蛋白质印迹法不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。总 CREBBP 检测使用两种标记抗体，一种偶联有供体荧光团，另一种偶联有受体荧光团。两种抗体均对该蛋白质上的特定表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在 CREBBP 时，加入这些偶联物会使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生 FRET 信号。信号强度与样品中该蛋白质的浓度直接成正比，并在免洗涤的检测形式下为评估蛋白质的表达水平提供了方法。

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总 CREBBP 双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，裂解后将裂解物转移至 384 孔小体积检测板，再加入总 CREBBP HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

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总 CREBBP 单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测总 CREBBP 可在单个用于培养、刺激和裂解的培养板中完成，无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现微型化操作，同时保持稳定的 HTRF 检测质量。

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检测验证

3 种 CREBBP/p300 PROTAC 作用机制的表征

实验采用贴壁细胞的双板检测方案进行。将 HeLa 细胞接种到 96 孔培养板中（每孔 70,000 个细胞，使用完全培养基），在 37°C、5% CO₂条件下培养过夜。次日，先用 1 µM 环氧霉素预处理细胞 1 小时，再用 3 种浓度的每种 CREBBP/p300 PROTAC 降解剂（PROTAC CBP/p300 Degrader-1、沙利度胺 - NH-CBP/P300 配体 2 或 dCBP-1）处理 5 小时，同时使用弹头 GNE-781 作为阴性对照（三种 PROTAC 共用同一种对照）。用 50 µL 补充的 1 号裂解缓冲液裂解细胞，然后将 16 µL 裂解物转移至小体积白色微孔板（ProxiPlate-384 Plus，货号 6008280/9）中，再加入 4 µL HTRF 总 CREBBP 或总 p300 试剂盒检测抗体（HTRF 总 p300 试剂盒，货号 64P300TPEG/Y）。两种检测均在过夜孵育后记录 HTRF 信号。通过将 5 µL 相同的裂解物转移至 HTRF 96 孔小体积白色板（货号 66PL96005/025/100）中，然后加入 25 µL ATPlite 1step 检测试剂（ATPlite 1step 发光检测系统，货号 6016736/1/9），评估细胞活力。在暗处孵育 10 分钟后测量发光信号。

处理 5 小时后，三种 CREBBP/p300 PROTAC 降解剂均诱导 CREBBP 和 p300 的信号呈剂量依赖性降低，而弹头 GNE-781 则无此作用，结果与预期一致。如 ATPlite 图表所示，在化合物存在的情况下未观察到细胞毒性作用。最后，在蛋白酶体抑制剂环氧霉素存在时，HTRF 信号得以恢复。综上，我们的结果明确表明，PROTAC 诱导的 CREBBP/p300 降解是由泛素 - 蛋白酶体系统介导的。