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ght-color: rgba(0, 0, 0, 0); font-size: var(--md-box-samantha-normal-text-font-size); line-height: var(--md-box-samantha-normal-text-line-height); overflow-anchor: auto; font-family: arial, helvetica, sans-serif; color: var(--md-box-samantha-deep-text-color) !important;">非诺贝特通过 AMPK 通路诱导 eNOS 磷酸化
将人脐静脉内皮细胞以 80% 的汇合度接种到 100mm 培养皿中,在 37°C、5% CO₂条件下培养,并进行过夜血清饥饿处理。随后,加入或不加入 30µM 的非诺贝特溶液处理 30 分钟。移除培养基后,加入裂解缓冲液。将 16µl 裂解物转移至 384 孔板中,用于总 eNOS 和 Ser1177 磷酸化 eNOS 的检测。


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总 eNOS 的蛋白质印迹法(WB)与 HTRF 检测比较

将人脐静脉内皮细胞在 160mm 培养皿中于 37°C、5% CO₂条件下培养 2 天。进行过夜血清饥饿处理后,用 30µM 过钒酸盐孵育 30 分钟。移除细胞培养基后,加入 3mL 补充裂解缓冲液,孵育 30 分钟。离心 10 分钟后收集可溶性上清液。使用等量的裂解物进行蛋白质印迹法与 HTRF 检测的平行比较。总 eNOS 检测的灵敏度高于蛋白质印迹法:HTRF 检测仅需 37,500 个细胞 /mL 即可检测到,而蛋白质印迹法则需要 75,000 个细胞 /mL。


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