产品概述

组织损伤后，炎症细胞局部释放的转化生长因子 -β（TGF-β）会激活局部成纤维细胞或静息状态的肝星状细胞（HSC）。这一过程会促使它们分化为肌成纤维细胞，肌成纤维细胞的作用是迁移至受损组织并合成细胞外基质（ECM）成分，以修复损伤。肌成纤维细胞的特征是重新表达 α- 平滑肌肌动蛋白（α-SMA），该蛋白会整合到肌动蛋白应力纤维中，为细胞赋予强收缩活性。慢性组织损伤会导致肌成纤维细胞（α-SMA 阳性）持续新生、过度收缩以及细胞外基质过度沉积，最终引发组织纤维化。

工作原理

检测原理

α-SMA 检测基于时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）双抗夹心免疫分析格式，包含两种抗体：一种标记铕离子穴状化合物（Eu³⁺-Cryptate，供体），另一种标记 d2（受体）。这两种抗体会特异性结合 α-SMA，当供体与受体靠近时，会产生荧光 TR-FRET 信号。（标注：Biomarkers how it works assay principle alpha sma 62asmapeg 62asmapeh 62asmapej 为图表 / 文件标识，通常保留原标识，可译为 “生物标志物 - α-SMA 检测原理”）

检测方案

双板检测方案：为提升灵活性，本检测可采用双板检测方案 —— 细胞在培养板中接种、处理并裂解后，将裂解液转移至 96 孔或 384 孔低体积检测微孔板中，再加入 HTRF 试剂进行检测。该方案可同时监测细胞的存活率和融合度。检测试剂可预先混合，通过单次加样步骤直接进行检测。本检测既适用于冷冻细胞裂解液，也适用于培养状态下的新鲜细胞。（标注：Biomarkers how it works assay protocol alpha sma 62asmapeg 为图表 / 文件标识，通常保留原标识，可译为 “生物标志物 - α-SMA 检测方案”）

检测验证

经 siRNA 实验验证的 α-SMA 亚型特异性

将人肝星状细胞系 LX-2 * 和小鼠成纤维细胞系 NIH/3T3 接种到经培养处理的 96 孔板中（每孔 10,000 个细胞），在 37°C、5% 二氧化碳条件下孵育 24 小时。次日，用 α-SMA 小干扰 RNA（siRNA）或阴性对照 siRNA 转染细胞 24 小时，之后用 2.5 ng/mL 的 TGF-β1 处理（或不处理）细胞，继续孵育 24 小时。去除培养基后，用添加补剂的 3 号裂解缓冲液裂解细胞（LX-2 细胞用 50 µL，NIH/3T3 细胞用 200 µL），在室温下温和振荡 30 分钟。取 16 µL 裂解液转移至低体积白色微孔板中，再加入 4 µL HTRF® α-SMA 检测抗体。结果显示，在两种细胞系中，与转染阴性对照 siRNA 的细胞相比，转染 α-SMA siRNA 的细胞其 HTRF 特异性信号显著降低（约 60%-70%），这表明 HTRF® α-SMA 检测对 α-SMA 亚型具有特异性，且不与其他肌动蛋白亚型发生交叉反应。* 注：LX-2 细胞系由 EMD Millipore 公司提供（产品编号 #SCC064）（标注：Assay validation alpha sma 1、Assay validation alpha sma 2 为图表 / 文件标识，通常保留原标识，可译为 “α-SMA 检测验证 1”“α-SMA 检测验证 2”）

肝星状细胞（HSC）分化为肌成纤维细胞过程中的 α-SMA 表达

将人肝星状细胞系 LX-2 * 接种到经培养处理的 96 孔板中（每孔 50,000 个细胞），使用完全培养基，在 37°C、5% 二氧化碳条件下孵育。次日，用梯度浓度的 TGF-β1 处理细胞 48 小时。去除培养基后，用 50 µL 添加补剂的 3 号裂解缓冲液裂解细胞，取 16 µL 裂解液转移至低体积白色微孔板中，再加入 4 µL HTRF® α-SMA 检测抗体。结果显示，TGF-β1 处理使 α-SMA 表达水平提高 2 倍，这一现象表明肝星状细胞已分化为肌成纤维细胞。* 注：LX-2 细胞系由 EMD Millipore 公司提供（产品编号 #SCC064）（标注：Assay validation alpha sma 3 为图表 / 文件标识，通常保留原标识，可译为 “α-SMA 检测验证 3”）

肺纤维化中人气道成纤维细胞（HLF）分化为肌成纤维细胞过程中的 α-SMA 表达

将人气道成纤维细胞（HLF）接种到经培养处理的 96 孔板中（每孔 20,000 个细胞），使用完全培养基，在 37°C、5% 二氧化碳条件下过夜孵育。随后，将细胞在无血清培养基中继续孵育 24 小时，再用梯度浓度的 TGF-β1 处理 48 小时。去除培养基后，用 50 µL 添加补剂的 3 号裂解缓冲液在室温下温和振荡裂解细胞 30 分钟，取 16 µL 裂解液转移至低体积白色微孔板中，再加入 4 µL HTRF® α-SMA 检测抗体。结果显示，TGF-β1 长期处理使 α-SMA 表达水平提高 4 倍，表明气道成纤维细胞已分化为肌成纤维细胞。（标注：Assay validation alpha sma 4 为图表 / 文件标识，通常保留原标识，可译为 “α-SMA 检测验证 4”）

成纤维细胞分化为肌成纤维细胞过程中的 α-SMA 表达

将小鼠成纤维细胞系 NIH/3T3 接种到经培养处理的 96 孔板中（每孔 6,250 个或 12,500 个细胞），使用完全培养基，在 37°C、5% 二氧化碳条件下孵育。次日，在添加 0.2% 牛血清白蛋白（BSA）的无血清、无抗生素培养基中，用梯度浓度的 TGF-β1 处理细胞 48 小时。去除培养基后，用 200 µL 添加补剂的 3 号裂解缓冲液在室温下温和振荡裂解细胞 30 分钟，取 16 µL 裂解液转移至低体积白色微孔板中，再加入 4 µL HTRF® α-SMA 检测抗体。室温过夜孵育后记录 HTRF 信号。结果显示，TGF-β1 长期处理使 α-SMA 表达水平提高 3 倍，证明成纤维细胞已分化为肌成纤维细胞。（标注：Assay validation alpha sma 5 为图表 / 文件标识，通常保留原标识，可译为 “α-SMA 检测验证 5”）

HTRF α-SMA 检测与蛋白质印迹（Western Blot）的比较

将 NIH/3T3 细胞接种到 T175 培养瓶中，在 37°C 条件下孵育 2 天。去除培养基后，在室温下温和振荡裂解细胞 30 分钟，离心 10 分钟后收集可溶性上清液。用添加补剂的裂解缓冲液对细胞裂解液进行系列稀释，取 16 µL 各稀释度的裂解液转移至低体积白色微孔板中，再加入 4 µL HTRF® α-SMA 检测试剂。同时，取等量裂解液通过蛋白质印迹法进行平行比较。结果显示，使用 HTRF® α-SMA 检测试剂，仅需 200 个细胞即可检测到最低信号；而蛋白质印迹法需 800 个细胞才能检测到显著信号。因此，HTRF® α-SMA 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 4 倍。（标注：Assay validation alpha sma 6 为图表 / 文件标识，通常保留原标识，可译为 “α-SMA 检测验证 6”）

简化通路

TGF-β 信号通路

TGF-β 是一种促纤维化细胞因子，也是主要的肌成纤维细胞诱导因子。SMAD 依赖性 TGF-β 信号通路会激活转录因子 SMAD2/3，进而启动 ACTA2 基因转录并促进 α-SMA（α- 平滑肌肌动蛋白）表达。这种特异性肌动蛋白亚型会整合到肌动蛋白应力纤维中，为细胞赋予分化后肌成纤维细胞特有的强收缩活性。此外，TGF-β 还可通过 SMAD 非依赖性通路传递信号，具体机制为激活 TAK1 依赖性激酶（p38、JNK、NF-κB）以及 AKT、ERK 激酶。（标注：Biomarkers tab4 tgf beta signaling pathway 62asmapeg 为图表 / 文件标识，通常保留原标识，可译为 “生物标志物 - TGF-β 信号通路”）

产品规格

其他规格

• 应用领域（Application）：蛋白质定量（Protein Quantification）
• 品牌（Brand）：HTRF
• 检测方式（Detection Modality）：HTRF（均相时间分辨荧光）
• 产品类别（Product Group）：试剂盒（Kit）
• 样本体积（Sample Volume）：16 微升（16 µL）
• 运输条件（Shipping Conditions）：干冰运输（Shipped in Dry Ice）
• 靶标类别（Target Class）：生物标志物（Biomarkers）
• 靶标物种（Target Species）：人（Human）
• 技术平台（Technology）：TR-FRET（时间分辨荧光共振能量转移）
• 治疗领域（Therapeutic Area）：心血管（Cardiovascular）、非酒精性脂肪性肝炎 / 纤维化（NASH/Fibrosis）
• 单位规格（Unit Size）：100,000 次检测（100,000 assay points）