概述

TAR DNA 结合蛋白 43（TDP-43）是一种参与 RNA 相关代谢的核酸结合蛋白。TDP-43 聚集体已被确认为肌萎缩侧索硬化症（ALS）和额颞叶变性（FTLD）的标志性物质，且在多种神经退行性疾病（即 TDP-43 蛋白病）中广泛存在。在病理状态下（如突变或调控异常），TDP-43 会在脑和脊髓神经元的细胞质中形成不可溶性包涵体。本 TDP-43 聚集体检测试剂盒可在细胞模型中快速检测人源和鼠源 TDP-43 聚集体。

工作原理

TDP-43 聚集体检测原理

TDP-43 聚集体的检测基于两种均相时间分辨荧光（HTRF）特异性信号的对比：一是对照状态（仅检测可溶性 TDP-43），二是解聚状态（检测总解聚型与可溶性 TDP-43）。解聚状态下 HTRF 信号的增强可反映 TDP-43 的聚集体水平。（图示：biomarkers-how-it-works-assay-principle-tdp43-62tdp43peg，TDP-43 检测原理相关图示）

TDP-43 解聚步骤

含 TDP-43 聚集体的样本需经过解聚步骤，以计算样本处理前后两种状态下 TDP-43 的聚集水平（样本解聚可参照右侧所述方案进行）。试剂盒中已提供该步骤所需试剂，极大提升操作便利性。样本可直接加入检测板（白色低体积板），随后用 HTRF 试剂进行检测。（图示：biomarkers-how-it-works-assay-protocol-disaggregation-tdp43，TDP-43 解聚步骤相关图示）

TDP-43 聚集体检测步骤

经处理的同一对照状态样本，或完成解聚步骤后的样本，可直接加入检测板（384 孔低体积白色板或 Revvity 96 孔低体积板，反应体积 20 微升），随后用 HTRF 试剂检测。标记 HTRF 供体和受体的抗体已预先混合，可通过单次加样完成添加，进一步简化检测流程。只需按比例调整各试剂添加体积，该检测即可适配最高 1536 孔板的检测规格。（图示：biomarkers-how-it-works-assay-protocol-tdp43，TDP-43 聚集体检测步骤相关图示）

TDP-43 聚集体检测数据分析

每个样本的聚集比率可反映样本中 TDP-43 聚集体的存在情况。若不存在不可溶性聚集体，样本的聚集比率约为 1 或低于 1。（图示：biomarkers-how-it-works-tdp-43-aggregation-1，TDP-43 聚集体数据分析相关图示）

检测验证

TDP-43 聚集体试剂盒在鼠源 Neuro2a 细胞系和人源 HeLa 细胞系中的验证

• 人源 HeLa 细胞以 2.5×10⁴个 / 孔和 5×10⁴个 / 孔的密度接种于 96 孔板，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时。
• 鼠源 Neuro2a 细胞以 5×10⁴个 / 孔和 1×10⁵个 / 孔的密度接种于 96 孔板，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时。

部分细胞用星孢菌素（一种已知的胱天蛋白酶激活剂，可切割 TDP-43 并诱导其 C 端片段聚集）刺激 6 小时（HeLa 细胞使用 1 微摩尔 / 升，Neuro2a 细胞使用 2 微摩尔 / 升），另一部分细胞不进行刺激。刺激结束后，移除细胞培养液，加入 50 微升 1× 补充裂解缓冲液 #1，在室温下轻轻振荡裂解 30 分钟。将相同处理条件下 3 个孔的样本合并，取 2 份 60 微升纯 HeLa 细胞裂解液（或 Neuro2a 细胞稀释裂解液，用补充裂解缓冲液按 1:4 稀释）转移至 96 孔板，随后进行解聚或对照检测步骤，具体如下：

1. 加入 10 微升解聚缓冲液 A 或对照检测缓冲液 C；
2. 在室温下孵育 15 分钟；
3. 加入 10 微升解聚缓冲液 B 或对照检测缓冲液 C。

处理完成后，取 16 微升各样本（解聚状态或对照检测状态）转移至 384 孔低体积白色微孔板，再加入 4 微升 HTRF TDP-43 检测试剂，孵育过夜后记录 HTRF 信号。结果符合预期：经星孢菌素处理的样本中，可检测到的 TDP-43 聚集体水平升高；而未刺激样本的聚集比率约为 1 或低于 1。这些结果不仅证明该检测试剂盒可兼容人源和鼠源样本，还提示不同细胞背景下 TDP-43 的聚集水平存在差异。（图示：assay-validation-tdp-43-aggregation-1、assay-validation-tdp-43-aggregation-2，TDP-43 聚集体试剂盒细胞系验证相关图示）

过表达野生型（WT）和突变型 TDP-43 的 HeLa 细胞模型中 TDP-43 聚集体的检测

将人源 HeLa 细胞（1×10⁵个 / 孔）接种于 96 孔板，使用 Lipofectamine 2000 转染试剂，每孔转染 200 纳克绿色荧光蛋白（GFP）标记的野生型全长 TDP-43 或 GFP 标记的突变型 TDP-43（C 端片段，220-414 位氨基酸）。在 37°C、5% CO₂条件下孵育 48 小时后，部分细胞用 1 微摩尔 / 升星孢菌素刺激 6 小时（星孢菌素为已知胱天蛋白酶激活剂，可切割 TDP-43 并诱导其 C 端片段聚集），另一部分细胞不进行刺激。随后移除细胞培养液，加入 50 微升 1× 补充裂解缓冲液 #1，在室温下轻轻振荡裂解 30 分钟。将相同处理条件下 3 个孔的样本合并，取 2 份 60 微升稀释裂解液（用补充裂解缓冲液按 1:4 稀释）转移至 96 孔板，随后进行解聚或对照检测步骤，具体如下：

1. 加入 10 微升解聚缓冲液 A 或对照检测缓冲液 C；
2. 在室温下孵育 15 分钟；
3. 加入 10 微升解聚缓冲液 B 或对照检测缓冲液 C。

处理完成后，取 16 微升各样本（解聚状态或对照检测状态）转移至 384 孔低体积白色微孔板，再加入 4 微升 HTRF TDP-43 检测试剂，孵育过夜后记录 HTRF 信号。结果符合预期：与未转染细胞相比，单独过表达野生型或突变型 TDP-43 均会使聚集比率升高；星孢菌素处理可进一步提高 TDP-43 聚集比率，且该效应在过表达突变型 TDP-43 的细胞中更为显著。（图示：assay-validation-tdp-43-aggregation-3，过表达 TDP-43 的 HeLa 细胞模型检测相关图示）

HTRF TDP-43 聚集体检测与蛋白质印迹法（Western Blot）的对比

将人源 HeLa 细胞接种于 T175 培养瓶，在完全培养液中于 37°C、5% CO₂条件下培养 3 天，直至细胞融合度达到 80%。用 1 微摩尔 / 升星孢菌素刺激细胞 6 小时后，加入补充裂解缓冲液裂解细胞。使用补充裂解缓冲液对细胞裂解液进行系列稀释，每个稀释度的样本均分别进行解聚处理或对照处理，具体步骤如下：

1. 取 60 微升样本；
2. 加入 10 微升解聚缓冲液 A 或对照检测缓冲液 C；
3. 在室温下孵育 15 分钟；
4. 加入 10 微升解聚缓冲液 B 或对照检测缓冲液 C。

处理完成后，取 16 微升各稀释度样本（解聚状态或对照检测状态）转移至低体积白色微孔板，再加入 4 微升 HTRF TDP-43 检测试剂，孵育过夜后记录 HTRF 信号。同时，取等量未解聚的裂解液，通过蛋白质印迹法进行平行对比检测。结果符合预期：蛋白质印迹法显示，星孢菌素处理可诱导产生 TDP-43 的 C 端片段（35 千道尔顿），该片段会形成不可溶性聚集体（数据未展示）。在本实验条件下，HTRF TDP-43 聚集体检测的灵敏度至少是蛋白质印迹法的 2 倍。（图示：assay-validation-tdp-43-aggregation-4，HTRF 检测与蛋白质印迹法对比相关图示）

简化通路

TDP-43 聚集体检测相关简化通路

TDP-43（TAR DNA 结合蛋白 43）是一种 DNA 和 RNA 结合蛋白，在 RNA 代谢中发挥关键作用。其主要定位于细胞核，同时可在细胞核与细胞质之间穿梭。在病理状态下（如应激或突变），TDP-43 会在细胞质中发生异常定位，还可能被切割为 C 端片段，进而导致泛素化、过度磷酸化的毒性聚集体积累，最终形成不可溶性包涵体。异常定位的可溶性 TDP-43 会被泛素化，随后通过蛋白酶体降解；而自噬系统则会在可能的情况下尝试清除不可溶性聚集体。在细胞水平上，TDP-43 聚集体的作用已在多种维持 RNA 代谢和细胞稳态的机制中被研究，例如蛋白酶体活性、自噬作用、线粒体毒性等相关机制。在肌萎缩侧索硬化症（ALS）、额颞叶痴呆（FTD）、阿尔茨海默病等神经退行性疾病中均发现了 TDP-43 包涵体，这提示 TDP-43 在神经退行性病变过程中具有重要作用，也为治疗方法的研发开辟了新方向。（图示：biomarkers-tab4-tdp43-simplified-pathway-62tdp43peg，TDP-43 聚集体相关简化通路图示）

规格参数

其他规格

• 应用领域（Application）：蛋白质定量（Protein Quantification）
• 品牌（Brand）：HTRF
• 检测方式（Detection Modality）：HTRF（均相时间分辨荧光技术）
• 产品类别（Product Group）：试剂盒（Kit）
• 样本体积（Sample Volume）：16 微升（16 µL）
• 运输条件（Shipping Conditions）：干冰运输（Shipped in Dry Ice）
• 靶标类别（Target Class）：生物标志物（Biomarkers）
• 技术平台（Technology）：TR-FRET（时间分辨荧光共振能量转移技术）
• 治疗领域（Therapeutic Area）：神经科学（Neuroscience）
• 单位规格（Unit Size）：500 个检测点（500 assay points）