概述

黑色素瘤分化相关基因 5（MDA-5，Melanoma Differentiation-Associated Gene 5）是一种视黄酸诱导基因 I 样受体（RIG-I-like receptor），可作为细胞质中的双链 RNA（double stranded RNA，dsRNA）传感器，在感知病毒感染以及激活抗病毒反应级联（包括诱导 I 型干扰素和促炎细胞因子）中发挥关键作用。已知 MDA-5 在执行核酸感知功能时，会沿 RNA 链形成聚集体（aggregates）。此外，MDA-5 还可能在增强自然杀伤细胞（natural killer cell，NK 细胞）功能方面发挥重要作用，并且可能参与多种肿瘤细胞系的生长抑制与凋亡过程。该 MDA-5 检测试剂盒与我们的 MDA-5 聚集检测试剂盒兼容，可从单个样本中同时分析聚集型 MDA-5 和总 MDA-5，从而获得更优的检测结果。

工作原理

MDA-5 检测原理

MDA-5 检测可对细胞裂解液中 MDA-5 的表达水平进行定量分析。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测完全基于微孔板操作，无需凝胶、电泳或转膜步骤。MDA-5 检测使用两种标记抗体：一种偶联供体荧光团（donor fluorophore），另一种偶联受体荧光团（acceptor）。两种抗体均对 MDA-5 蛋白上的特定表位（epitope）具有高度特异性。当细胞提取物中存在 MDA-5 时，加入这些偶联抗体后，供体荧光团与受体荧光团会相互靠近，进而产生荧光共振能量转移（FRET，Fluorescence Resonance Energy Transfer）信号。该信号强度与样本中 MDA-5 蛋白的浓度直接成正比，且该检测采用免洗涤（no-wash）检测格式，为评估蛋白表达水平提供了便捷方法。（图示：1biomarkers-how-it-works-assay-principle-mda5-total-63adk112peg-63adk112peh.svg，MDA-5 检测原理相关图示）

MDA-5 双板检测方案

双板检测方案的流程如下：先在 96 孔板中培养细胞，随后进行细胞裂解；将裂解液转移至 384 孔低体积检测板中，再加入 MDA-5 均相时间分辨荧光（HTRF，Homogeneous Time-Resolved Fluorescence）检测试剂。该方案可对细胞活力（viability）和融合度（confluence）进行监测。（注：原文中检测方案图示编号为 “2biomarkers-how-it-works-assay-protocol-alpha-tubulin-63adk072peg-63adk072peh.svg”，标注为 α- 微管蛋白检测方案，推测为文本错植，此处保留图示编号并明确对应 MDA-5 双板检测方案）（图示：2biomarkers-how-it-works-assay-protocol-alpha-tubulin-63adk072peg-63adk072peh.svg，MDA-5 双板检测方案相关图示）

MDA-5 单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测 MDA-5 可在单个微孔板中完成，该板可同时用于细胞培养、刺激处理和裂解操作，且无需洗涤步骤。此方案专为高通量筛选（HTS，High-Throughput Screening）设计，可在实现实验微型化的同时，保持稳定可靠的 HTRF 检测质量。（图示：2phospho-how-it-works-total-btk-1-plate-assay-protocol.svg，MDA-5 单板检测方案相关图示）

检测验证

聚肌苷酸 - 聚胞苷酸（Poly I:C）刺激 HUTU80 细胞后 MDA-5 的检测

将 HUTU80 细胞接种到含完全培养基（complete culture medium）的 96 孔板中，在 37°C、5% 二氧化碳（CO₂）条件下孵育。次日，用含聚肌苷酸 - 聚胞苷酸（Poly I:C，高分子量 / HMW，High Molecular Weight）/ 脂质载体（LyoVec）的低血清培养基（含 0.5% 胎牛血清 / FBS，Fetal Bovine Serum）处理细胞，在 37°C、5% 二氧化碳环境中孵育 2 小时。处理完成后，加入补充型 3 号裂解缓冲液（supplemented lysis buffer #3），在室温（RT，Room Temperature）下轻轻振荡 30 分钟以裂解细胞；取 16 微升（µL）裂解液，分两次转移至低体积白色微孔板中，随后加入 4 微升预混合的 HTRF MDA-5 聚集检测试剂或总 MDA-5 检测试剂。孵育过夜（ON，Overnight）后，记录 HTRF 信号。（图示：2assay-validation-mda5-total-1.svg，MDA-5 检测验证相关图示）

简化通路

MDA-5 的功能与调控

MDA-5 作为细胞质中的病毒核酸传感器，其配体（ligand）包括 5' 端帽结构（5' cap）缺乏 2'-O - 甲基化（2'-O-methylation）的 mRNA，以及长度超过 1 千碱基（kb，kilobase）的双链 RNA（dsRNA）。当 MDA-5 与双链 RNA 结合时，其折叠状态会发生改变，进而触发自身聚集。聚集后的 MDA-5 会与线粒体抗病毒信号蛋白（MAVS，Mitochondrial Antiviral Signaling Protein）结合，激活 IKK 相关激酶 ——TANK 结合激酶 1（TBK1，TANK-Binding Kinase 1）和 IκB 激酶 ε（IKBKE，IκB Kinase Epsilon）。这些激酶随后会磷酸化干扰素调节因子 3（IRF3，Interferon Regulatory Factor 3）和干扰素调节因子 7（IRF7，Interferon Regulatory Factor 7），磷酸化后的 IRF3 和 IRF7 可激活抗病毒免疫相关基因的转录，其中包括 I 型干扰素（IFNs，Interferons）中的 α 干扰素（IFN-α，Interferon-Alpha）和 β 干扰素（IFN-β，Interferon-Beta）。（图示：3biomarkers-tab4-mda5-total-simplified-pathway-63adk112peg-63adk112peh-63adk112pej.svg，MDA-5 简化通路相关图示）

规格参数

其他规格

• 应用领域（Application）：蛋白质定量（Protein Quantification）
• 品牌（Brand）：HTRF
• 检测方式（Detection Modality）：HTRF（均相时间分辨荧光技术）
• 分子修饰类型（Molecular Modification）：总蛋白（Total）
• 产品类别（Product Group）：试剂盒（Kit）
• 样本体积（Sample Volume）：16 微升（16 µL）
• 运输条件（Shipping Conditions）：干冰运输（Shipped in Dry Ice）
• 靶标类别（Target Class）：生物标志物（Biomarkers）
• 靶标物种（Target Species）：人（Human）
• 技术平台（Technology）：TR-FRET（时间分辨荧光共振能量转移技术，Time-Resolved Fluorescence Resonance Energy Transfer）
• 治疗领域（Therapeutic Area）：感染性疾病（Infectious Diseases）、炎症（Inflammation）
• 单位规格（Unit Size）：10000 个检测点（10,000 assay points）