产品概述

本试剂盒用于简单快速地解聚多种聚集蛋白，如 β 淀粉样蛋白 1-42、TDP-43 或 α- 突触核蛋白。聚集蛋白由细胞产生，可在细胞膜裂解后或直接在细胞培养液中分泌后进行解聚。细胞裂解液或细胞培养液中的解聚蛋白水平，可通过对应目标蛋白的专用免疫分析法检测。

工作原理

蛋白解聚试剂盒原理

解聚原理基于两步连续加样，无需离心。向样本中加入解聚缓冲液 A，室温孵育 15 分钟，随后加入解聚缓冲液 B。同一样本还需用对照检测缓冲液 C 处理，以设置合适对照。处理后，样本可直接用于免疫分析。含有蛋白聚集物的样本（经对照缓冲液 C 处理）产生的信号，可与经解聚试剂 A 和 B 处理的同一样本信号进行比较。同一样本的解聚 / 聚集信号比值与蛋白聚集水平成正比。（图示：protein-disaggregation-kit，蛋白解聚试剂盒原理相关图示）

蛋白解聚试剂盒方案

• 解聚组：取 60 µL 样本，依次加入 10 µL 解聚缓冲液 A 和 10 µL 解聚缓冲液 B，无需添加对照检测缓冲液 C。
• 对照组：取 60 µL 样本，不添加解聚缓冲液 A 和 B，分两次各加入 10 µL 对照检测缓冲液 C（总计 20 µL）。

检测验证

重组 β 淀粉样蛋白 1-42 的蛋白解聚试剂盒验证

简要步骤：在低吸附微量离心管中，将人 β 淀粉样蛋白 1-42 肽段稀释于 10 mM 磷酸钠缓冲液（pH 7.4）中，终体积 600 µL，终浓度 30 µM。微量离心管在 25°C 下静置孵育，在多个时间点取样，稀释至 325 ng/mL，液氮速冻后于 - 80°C 储存。硫代黄素 T 分析：取 20 µL 样本与 6 µL 100 µM 硫代黄素 T 溶液及 14 µL 甘氨酸缓冲液（pH 8.3）混合。在 96 孔半区黑色透明底聚苯乙烯板中孵育 15 分钟后，以 444 nm 为激发波长、485 nm 为发射波长读取硫代黄素 T 荧光值（图中蓝色柱形）。HTRF 分析：样本用稀释液 5 按 1:100 稀释，经解聚试剂处理后，使用人 β 淀粉样蛋白 1-42 HTRF 试剂盒（货号 62B42PEG）进行分析。根据解聚试剂方案分析 HTRF 结果，计算解聚比值（图中红色柱形）。（图示：protein-disaggregation-kit，重组 β 淀粉样蛋白 1-42 验证相关图示）

线虫来源 β 淀粉样蛋白 1-42 的蛋白解聚试剂盒验证

简要步骤：为每个测试条件（25°C 刺激 24 小时组和未刺激组）制备 5000 条秀丽隐杆线虫。分析前，洗涤线虫并离心形成沉淀，小心分离沉淀与上清液，分别液氮速冻后于 - 80°C 储存。沉淀加入 500 µL 含蛋白酶抑制剂的 1X 裂解缓冲液 1，在 1.5 mL 微量离心管中冰上超声破碎 20 秒。样本分装后于 - 80°C 储存，后续使用人 β 淀粉样蛋白 1-42 HTRF 试剂盒及在 HTRF 1 号裂解缓冲液中制备的标准曲线进行分析。（图示：protein-disaggregation-kit，线虫来源 β 淀粉样蛋白 1-42 验证相关图示）

重组 α- 突触核蛋白的蛋白解聚试剂盒验证

将重组野生型（单体）和 A53T 突变型（纤维状突变体，与帕金森病相关）α- 突触核蛋白稀释至浓度 100 ng/mL。按照试剂盒方案，取 60 µL 样本，依次加入 10 µL 解聚缓冲液 A 和 10 µL 解聚缓冲液 B，或分两次各加入 10 µL 对照检测缓冲液 C，用蛋白解聚试剂盒试剂处理样本。处理后的样本用于 α- 突触核蛋白聚集 HTRF 试剂盒，按照试剂盒说明书孵育过夜。经对照缓冲液 C 处理的样本，其 HTRF 比值呈现预期模式：A53T 纤维状突变体的 HTRF 比值更高 —— 这与 α- 突触核蛋白聚集试剂盒仅检测聚集态 α- 突触核蛋白的设计目标一致。经解聚缓冲液 A 和 B 处理后，单体和纤维状蛋白的 HTRF 比值相近，明确表明解聚试剂可有效将纤维状 A53T 蛋白解聚为单体形式，而该单体形式无法被 α- 突触核蛋白聚集试剂盒检测到。（图示：protein-disaggregation-kit，重组 α- 突触核蛋白验证相关图示）

TDP-43 聚集物检测的蛋白解聚试剂盒验证

在 96 孔板中，每孔接种 100,000 个人 HeLa 细胞，使用 Lipofectamine 2000 转染 200 ng GFP-TDP-43 野生型（全长）或 GFP-TDP-43 突变体（C 端片段 220-414 位氨基酸）。孵育 48 小时后，用 1 µM 星形孢菌素（一种公认的半胱天冬酶激活剂，可切割 TDP-43 并诱导 C 端片段聚集）刺激细胞 6 小时。加入 50 µL 含补剂的 1 号裂解缓冲液裂解细胞，将相同条件的 3 孔样本合并，取 2 份 60 µL 1:4 稀释的裂解液转移至 96 孔板，分别进行解聚处理或对照检测处理。处理后，取 16 µL 每个样本（解聚组或对照检测组）转移至 384 孔低体积白色微孔板，加入 4 µL HTRF TDP-43 检测试剂，孵育过夜后记录 HTRF 信号。野生型或突变型 TDP-43 的过表达预期会增加 TDP-43 水平，而这些效应仅在样本经解聚缓冲液 A+B 处理后才能清晰显现。对照组（未解聚的缓冲液 C 处理组）信号较低，且各测试条件间无显著差异 —— 这是因为表位在高阶聚集结构中被掩盖。解聚后，基础 TDP-43 水平更易检测，转染效应与未转染细胞相比存在显著差异，且野生型和突变型 TDP-43 之间也存在显著差异。根据试剂盒说明书计算聚集比值，结果如图中红色所示。该结果明确表明，在研究易形成高度聚集结构的蛋白时，使用解聚试剂至关重要，可获得无偏倚且更具生物学意义的信息。（图示：protein-disaggregation-kit，TDP-43 聚集物检测验证相关图示）

产品规格

其他规格

• 应用领域：Protein Quantification
• 品牌：HTRF
• 检测方式：HTRF
• 裂解缓冲液兼容性：Lysis Buffer 1
• 产品类别：Kit
• 样本体积：16 µL
• 运输条件：常温运输
• 靶标类别：Biomarkers
• 技术平台：TR-FRET
• 单位规格：100 assay points