产品概述

缺氧诱导因子 - 1α（HIF-1α）是转录因子缺氧诱导因子 - 1（HIF-1）的两个亚基之一。HIF-1 作为细胞和机体缺氧应答的核心调控因子，可激活与能量代谢、血管生成、细胞凋亡等相关基因的转录。HIF-1 高表达与肿瘤的侵袭性进展相关。HIF-1α 还通过参与靶细胞的葡萄糖摄取，与糖尿病密切相关，同时也涉及糖尿病肾病、糖尿病创面修复等糖尿病并发症。

工作原理

检测原理

HIF-1α HTRF 检测采用双抗夹心免疫分析法，涉及两种特异性抗人 HIF-1α 抗体，分别标记铕穴状化合物（供体）和 d2（受体）。信号强度与样本中 HIF-1α 的浓度成正比。检测试剂可预先混合，通过单次加样步骤直接检测，全程无需洗涤。细胞裂解后，可使用 HIF-1α 细胞水平 HTRF 试剂盒试剂和大多数时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）多功能酶标仪检测 HIF-1α。（图示：hif-1-alpha-cellular-kit，HIF-1α 检测原理相关图示）

检测方案

双板检测方案

细胞在同一 96 孔培养板中接种、刺激处理并裂解，随后将裂解液转移至检测板，使用 HTRF 试剂检测 HIF-1α。该方案可监测细胞的活力和融合度。标记 HTRF 荧光团的抗体可预先混合，通过单次加样步骤加入，进一步简化检测流程。通过按比例调整各试剂的添加体积，检测可在 96 孔至 384 孔板中进行。（图示：hif-1-alpha-cellular-kit，HIF-1α 双板检测方案相关图示）

检测详情

HTRF 检测与 Western Blot 的对比

将人 HeLa 宫颈癌细胞接种到 T175 培养瓶的完全培养基中，在 37°C、5% 二氧化碳条件下培养 2 天，直至融合度达到 80%。经处理（6 小时，10 微摩尔 / 升 MG-132，1 毫摩尔 / 升 DMOG）后，加入 3 毫升含补剂的 4 号裂解缓冲液，室温温和振荡 30 分钟裂解细胞。离心 10 分钟后收集可溶性上清液，用含补剂的裂解缓冲液对细胞裂解液进行系列稀释。取 16 微升各稀释液转移至 384 孔低体积白色微孔板，加入 4 微升 HIF-1α HTRF 检测试剂。同时取等量裂解液进行 Western Blot 检测，进行平行对比。结果显示：HTRF 检测仅需 3120 个细胞即可检测到最低信号，而 Western Blot 需 25,000 个细胞；HTRF 检测的灵敏度是 Western Blot 的 8 倍。（图示：hif-1-alpha-cellular-kit，与 Western Blot 对比相关图示）

羟化酶和蛋白酶体抑制剂的作用

将小鼠胚胎成纤维细胞 NIH-3T3 接种到 96 孔板，每孔 100,000 个细胞。在 37°C 下，用不同浓度的羟化酶抑制剂 DMOG（防止 HIF-1α 羟化）或蛋白酶体抑制剂 MG-132（抑制 HIF-1α 降解）处理 6 小时（每组设 3 个复孔）。移除培养基后，加入 50 微升含补剂的 4 号裂解缓冲液，室温温和振荡 30 分钟裂解细胞，取 16 微升裂解液转移至 384 孔板进行 HTRF 检测。（图示：hif-1-alpha-cellular-kit，羟化酶和蛋白酶体抑制剂作用相关图示）

HIF-1α 与磷酸化 Erk1/2 的相关性

将人 A431 表皮样癌细胞接种到 96 孔板，每孔 100,000 个细胞。用 1 毫摩尔 / 升 DFO 预孵育 30 分钟（防止 HIF-1α 降解）后，在 37°C 下用不同浓度的表皮生长因子（EGF）处理 6 小时，以激活 ERK 通路和 HIF-1α 的转录。移除培养基后，加入 50 微升含补剂的 4 号裂解缓冲液，室温温和振荡 30 分钟裂解细胞，取 16 微升裂解液转移至 384 孔板的两个不同孔中，进行平行检测。（图示：hif-1-alpha-cellular-kit，HIF-1α 与磷酸化 Erk1/2 相关性相关图示）

IGF-1 刺激后 HIF-1α 的上调

将人 MCF-7 表皮样癌细胞接种到 96 孔板，每孔 50,000 个细胞。用 1 毫摩尔 / 升 DFO 预孵育 30 分钟（防止 HIF-1α 降解）后，在 37°C 下用不同浓度的 IGF-1 处理 6 小时，以激活 AKT 通路和 HIF-1α 的转录。移除培养基后，加入 50 微升含补剂的 4 号裂解缓冲液，室温温和振荡 30 分钟裂解细胞，取 16 微升裂解液转移至 384 孔低体积白色微孔板进行检测。（图示：hif-1-alpha-cellular-kit，IGF-1 刺激后 HIF-1α 上调相关图示）

PI3K 抑制剂处理后 HIF-1α 和磷酸化 AKT 的下调

将人 MCF-7 表皮样癌细胞接种到 96 孔板，每孔 50,000 个细胞。用不同浓度的 1 毫摩尔 / 升 DFO 预孵育 30 分钟（防止 HIF-1α 降解）后，在 37°C 下用不同浓度的 PI3K 抑制剂 LY294002 处理 30 分钟（每组设 3 个复孔），以抑制 PI3K/AKT 通路。随后用 10 纳摩尔 / 升 IGF-1 和 1 毫摩尔 / 升 DFO 激活细胞，移除培养基后，加入 50 微升含补剂的 4 号裂解缓冲液，室温温和振荡 30 分钟裂解细胞，取 16 微升裂解液转移至 384 孔板的两个不同孔中，进行平行检测。（图示：hif-1-alpha-cellular-kit，PI3K 抑制剂处理后下调相关图示）

简化通路

HIF-1 由组成型表达的 HIF-1β 亚基（87 千道尔顿）和氧调控的 HIF-1α 亚基（120 千道尔顿）组成，后者含有氧依赖性降解结构域（ODD）。常氧条件下，HIF-1α 的 ODD 结构域被氧激活的脯氨酰羟化酶（PHDs）羟化，导致其快速泛素化并通过蛋白酶体降解。缺氧条件下，PHD 活性受到抑制，HIF-1α 在细胞质中积累并转运至细胞核，与 HIF-1β 异源二聚化后激活。该复合物可激活超过 100 个靶基因的转录，通过编码参与血管生成、红细胞生成、细胞增殖 / 存活和炎症的相关蛋白，协助细胞适应缺氧环境。（图示：hif-1-alpha-cellular-kit，HIF-1 信号通路相关图示）

产品规格

其他规格

• 应用领域：Protein Quantification
• 品牌：HTRF
• 检测方式：HTRF
• 产品类别：Kit
• 样本体积：16 µL
• 运输条件：干冰运输
• 靶标类别：Biomarkers
• 靶标物种：人、小鼠
• 技术平台：TR-FRET
• 治疗领域：Metabolism/Diabetes、NASH/Fibrosis、Oncology & Inflammation
• 单位规格：500 assay points