产品概述

裂解型 PARP（Asp214）试剂盒可特异性定量检测人、小鼠和猴体内内源性的 PARP-1 大片段（89 kDa）。PARP-1 位于半胱天冬酶 3 和 7 的下游核心位置，而这两种酶可被外源性和内源性凋亡途径激活，因此裂解型 PARP-1 是细胞凋亡的相关标志物。凋亡失调与多种疾病相关：细胞死亡不足会引发癌症、自身免疫性疾病和持续性感染等；而过度凋亡则可能导致神经退行性疾病和缺血性疾病。

工作原理

检测原理

裂解型 PARP 检测基于双抗夹心免疫分析技术，采用两种特异性抗 PARP-1 p85 片段单克隆抗体：一种标记铕离子穴状化合物（Eu³⁺ Cryptate，供体），另一种标记 d2（受体）。供体与受体的近距离接触会产生荧光时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）信号，信号强度与凋亡细胞数量成正比。该方案优化适用于 384 孔板格式，也可轻松实现微型化或规模化扩展。细胞裂解后，可使用 HTRF 裂解型 PARP-Asp214 试剂盒试剂对半定量检测裂解型 PARP-1 p85 片段。（图示：biomarkers-how-it-works-assay-principle-cleaved-parp-1，裂解型 PARP 检测原理相关图示）

检测方案

双板检测方案：为提升灵活性，该检测可采用双板方案 —— 先在 96 孔培养板中接种细胞并进行处理，随后将裂解液转移至 384 孔小体积检测板中，加入检测试剂即可。检测试剂可预先混合，通过单次加样步骤直接检测，全程无需洗涤。这种方案还能在合适的细胞培养板中监测细胞存活率和汇合度。（图示：biomarkers-how-it-works-assay-protocol-cleaved-parp-1，裂解型 PARP 检测方案相关图示）

检测验证

HTRF 与 Western Blot 对比实验

Jurkat 细胞在 T175 培养瓶中于 37°C、5% 二氧化碳条件下培养，经星形孢菌素刺激 4 小时后，离心去除培养基，用 3 毫升添加补剂的裂解缓冲液室温裂解细胞 30 分钟。离心 10 分钟后收集上清液，用添加补剂的裂解缓冲液进行系列稀释，取 16 微升各稀释液分别通过 Western Blot 和 HTRF 进行平行分析。结果显示：HTRF 裂解型 PARP Asp214 细胞检测仅需 3125 个细胞即可产生最低检测信号，而 Western Blot 则需要 12500 个细胞，表明 HTRF 细胞检测的灵敏度高于 Western Blot。（图示：assay-validation-parp-cleaved-asp214-1，HTRF 与 Western Blot 对比相关图示）

星形孢菌素处理的 HeLa 细胞中裂解型 PARP-1 检测

将 5×10⁴个人宫颈癌 HeLa 细胞接种到 96 孔板中，37°C、5% 二氧化碳条件下孵育 24 小时。加入梯度浓度的星形孢菌素孵育 4 小时后，去除培养基，用 50 微升裂解缓冲液室温温和振荡裂解细胞 30 分钟。取 16 微升裂解液转移至 384 孔小体积白色微孔板，加入 4 微升 HTRF 裂解型 PARP Asp214 检测试剂，室温孵育 2 小时后记录 HTRF 信号。（图示：assay-validation-parp-cleaved-asp214-2，HeLa 细胞检测相关图示）

星形孢菌素处理的 C2C12 细胞中裂解型 PARP-1 检测

将 5×10⁴个小鼠成肌细胞 C2C12 接种到 96 孔板中，37°C、5% 二氧化碳条件下孵育 24 小时。加入梯度浓度的星形孢菌素孵育 4 小时后，去除培养基，用 50 微升裂解缓冲液室温温和振荡裂解细胞 30 分钟。取 16 微升裂解液转移至 384 孔小体积白色微孔板，加入 4 微升 HTRF 裂解型 PARP Asp214 检测试剂，室温孵育 2 小时后记录 HTRF 信号。（图示：assay-validation-parp-cleaved-asp214-3，C2C12 细胞检测相关图示）

简化通路

裂解型 PARP 通路

两条途径可激活效应原半胱天冬酶 3，进而在 Asp214 位点切割 PARP，引发凋亡：

• 外源性途径：由肿瘤坏死因子 α、Fas 配体、载脂蛋白 L 等死亡配体结合其死亡受体激活，启动起始原半胱天冬酶 8。
• 内源性途径（线粒体途径）：由应激、辐射、毒素、缺氧、生长因子缺乏等细胞损伤激活，进而激活 BAD 等促凋亡因子，启动起始原半胱天冬酶 9。

当死亡配体结合或细胞受损，外源性或内源性凋亡途径被激活后，参与 DNA 损伤修复的核酶 PARP-1（116 kDa）会被激活的半胱天冬酶 3 和 7 在 Asp214 与 Gly215 之间切割。该切割会使酶失活 —— 将 N 端 DNA 结合结构域 p25（24 kDa）与 C 端催化结构域 p85（89 kDa）分离，最终导致 DNA 片段化和细胞凋亡。裂解型 PARP-1 被视为凋亡的关键标志物。（图示：biomarkers-tab4-cleaved-parp-1-pathway-64parpeg-64parpeh.svg，裂解型 PARP 通路相关图示）

产品规格

其他规格

• 应用领域：Protein Quantification
• 品牌：HTRF
• 检测方式：HTRF
• 产品类别：Kit
• 样本体积：16 µL
• 运输条件：干冰运输
• 靶标类别：Biomarkers
• 靶标物种：人、小鼠
• 技术平台：TR-FRET
• 治疗领域：Cardiovascular、Infectious Diseases、Metabolism/Diabetes、NASH/Fibrosis、Neuroscience、Rare Diseases
• 单位规格：10,000 assay points