产品概述

去除受损线粒体对维持细胞稳态至关重要。线粒体外膜转运酶（TOM）受体复合物负责将蛋白质穿过线粒体外膜转运至膜间隙，而 TOM20 是 TOM 复合物的核心组分。监测 TOM20 的降解情况可作为线粒体自噬激活的指标。本试剂盒用于检测细胞裂解液中的 TOM20，凭借 “添加即检测”（Add and Read）的简便操作流程，成为酶联免疫吸附试验（ELISA）的快速替代方案。

工作原理

检测原理

TOM20 的检测采用双抗夹心免疫分析技术，使用两种特异性抗 TOM20 抗体，分别标记 HTRF 供体染料和受体染料。信号强度与样本中 TOM20 的浓度直接成正比。（图示：Assay principle human mouse，TOM20 检测原理相关图示）

检测方案

双板检测方案流程：先在 96 孔板中培养细胞，裂解后将裂解液转移至 384 孔低体积检测板，再加入 TOM20 HTRF 检测试剂。该方案可同步监测细胞的存活率和汇合度。（图示：Assay human mouse tom，TOM20 双板检测方案相关图示）

分析性能

试剂盒特性

• 出结果时间：室温过夜（ON at RT）
• 检测限（LOD）与定量限（LOQ）（稀释液中）：25 pg/mL 与 45 pg/mL
• 检测范围：45–5000 pg/mL

精密度

批内精密度（n=24）

• 每个样本检测 24 次，计算各样本的变异系数（% CV）
• 样本 1：TOM20 均值 109 pg/mL，变异系数（CV）5.5%
• 样本 2：TOM20 均值 590 pg/mL，变异系数（CV）1.9%
• 样本 3：TOM20 均值 2048 pg/mL，变异系数（CV）2.1%
• 平均 CV：3.7%

批间精密度（n=4）

• 每个样本在 4 个独立实验中检测，计算各样本浓度的变异系数（% CV）
• 样本 1：TOM20 含量 156 pg/mL，delta 比值均值 588，变异系数（CV）11%
• 样本 2：TOM20 含量 625 pg/mL，delta 比值均值 3604，变异系数（CV）5%
• 样本 3：TOM20 含量 2500 pg/mL，delta 比值均值 17989，变异系数（CV）9%
• 平均 CV：6%

检测验证

缬氨霉素诱导人 SH-SY5Y 细胞系的线粒体自噬

将人神经母细胞瘤 SH-SY5Y 细胞以 5×10⁴个 / 孔接种到 96 孔板中，使用完全培养基（DMEM/F-12、10 mM HEPES + 10% 胎牛血清）在 37°C、5% 二氧化碳条件下过夜培养。次日更换培养基，加入梯度浓度的线粒体解偶联剂缬氨霉素，在 37°C、5% 二氧化碳条件下孵育 24 小时。去除培养基后，用 50 微升 1X 添加补剂的 4 号裂解缓冲液室温温和振荡裂解细胞 30 分钟，取 16 微升裂解液转移至低体积白色微孔板，再加入 4 微升 HTRF TOM20 检测抗体。室温过夜孵育后记录 HTRF 信号，信号值通过 TOM20 标准品系列稀释建立的校准曲线进行插值计算。同时，取 14 微升裂解液进行 HTRF 泛素磷酸化 - S65 检测，作为缬氨霉素介导线粒体自噬激活的对照实验。（图示：Human mouse tom、Assay validation human mouse tom，线粒体自噬检测验证相关图示）

简化通路

简化通路说明

在去极化诱导的线粒体自噬过程中，结合在线粒体外膜的 PTEN 诱导激酶 1（PINK1）通过二聚化和自身磷酸化被激活。激活后的 PINK1 会磷酸化泛素连接酶 Parkin 其泛素样结构域的 Ser65 位点，同时也会磷酸化线粒体外膜上的泛素化蛋白（包括 TOM20）。TOM20 泛素化后会被转运至蛋白酶体降解，最终导致磷酸化泛素浓度升高，而 TOM20 浓度降低。（图示：Simplified pathway tom，TOM20 相关简化通路图示）

产品规格

其他规格

• 应用领域：Protein Quantification（蛋白定量）
• 兼容自动化：是（Automation Compatible: Yes）
• 品牌：HTRF
• 检测方式：HTRF
• 裂解缓冲液兼容性：1 号裂解缓冲液、4 号裂解缓冲液
• 产品类别：Kit
• 样本体积：16 µL
• 运输条件：干冰运输
• 靶标类别：Biomarkers（生物标志物）
• 靶标物种：人（Human）、小鼠（Mouse）
• 技术平台：TR-FRET
• 治疗领域：Oncology & Inflammation（肿瘤学与炎症）
• 单位规格：10,000 assay points