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HTRF ANTI 6HIS-EU - KINASE BIND. 1K PTS 6组氨酸K激酶结合测量试剂 - 1，000测试

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上海普纳生物技术有限公司
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将小鼠神经母细胞瘤细胞系 Neuro-2a 以每孔 100,000 个细胞的密度，用完全培养基接种到 96 孔培养处理板中，在 37°C、5% 二氧化碳条件下孵育过夜。用浓度递增的普拉替尼（Pralsetinib）处理细胞 2 小时，在处理结束前 30 分钟加入 100 微摩尔过钒酸盐。加入 50 微升补充后的 4 号裂解缓冲液，在室温下轻柔振荡裂解 30 分钟。检测阶段，取 16 微升细胞裂解液转移至 384 孔小体积白色微孔板，加入 4 微升均相时间分辨荧光 RET 磷酸化（泛特异性）或 RET 总蛋白检测试剂。孵育过夜后，记录均相时间分辨荧光信号。


结果符合预期：RET 激酶抑制剂普拉替尼以剂量依赖性方式降低 RET 磷酸化水平，但对 RET 受体的表达水平无影响。


assay-validation-ret-total-3（图示：RET 总蛋白检测验证 3）

人神经母细胞瘤 SH-SY5Y 细胞中 RET 磷酸化的抑制

将人神经母细胞瘤细胞系 SH-SY5Y 以每孔 100,000 个细胞的密度，用完全培养基接种到 96 孔培养处理板中，在 37°C、5% 二氧化碳条件下孵育过夜。用浓度递增的普拉替尼和塞普替尼（Selpercatinib）处理细胞 2 小时，在处理结束前 30 分钟加入 100 微摩尔过钒酸盐。加入 50 微升补充后的 4 号裂解缓冲液，在室温下轻柔振荡裂解 30 分钟。检测阶段，取 16 微升细胞裂解液转移至 384 孔小体积白色微孔板，加入 4 微升均相时间分辨荧光 RET 磷酸化（泛特异性）或 RET 总蛋白检测试剂。孵育过夜后，记录均相时间分辨荧光信号。


结果符合预期：两种 RET 激酶抑制剂均以剂量依赖性方式降低 RET 磷酸化水平，但对 RET 受体的表达水平无影响。


assay-validation-ret-total-4（图示：RET 总蛋白检测验证 4）
assay-validation-ret-total-5（图示：RET 总蛋白检测验证 5）

人肺腺癌细胞系 LC-2/ad 中 RET 磷酸化的抑制

将人肺腺癌细胞系 LC-2/ad 以每孔 50,000 个细胞的密度，用完全培养基接种到 96 孔培养处理板中，在 37°C、5% 二氧化碳条件下孵育过夜。用浓度递增的普拉替尼处理细胞 2 小时，在处理结束前 30 分钟加入 100 微摩尔过钒酸盐。加入 50 微升补充后的 4 号裂解缓冲液，在室温下轻柔振荡裂解 30 分钟。检测阶段，取 16 微升细胞裂解液转移至 384 孔小体积白色微孔板，加入 4 微升均相时间分辨荧光 RET 磷酸化（泛特异性）或 RET 总蛋白检测试剂。孵育过夜后，记录均相时间分辨荧光信号。


结果符合预期：RET 激酶抑制剂普拉替尼以剂量依赖性方式降低 RET 磷酸化水平，但对 RET 受体的表达水平无显著影响。


assay-validation-ret-total-6（图示：RET 总蛋白检测验证 6）

RET 总蛋白均相时间分辨荧光检测与蛋白质印迹法的比较

将 SH-SY5Y 细胞在 T175 培养瓶中用完全培养基培养 48 小时，培养条件为 37°C、5% 二氧化碳。用 100 微摩尔过钒酸盐处理细胞 30 分钟，随后加入 3 毫升补充后的 4 号裂解缓冲液，在室温下轻柔振荡裂解 30 分钟。


用补充后的裂解缓冲液对细胞裂解液进行系列稀释，取 16 微升各稀释度裂解液转移至小体积白色微孔板，加入 4 微升 RET 总蛋白均相时间分辨荧光检测试剂。取等量裂解液用于均相时间分辨荧光检测与蛋白质印迹法的平行对比。


结果显示：使用 RET 总蛋白均相时间分辨荧光检测时，每孔 3,400 个细胞即可检测到显著信号；而使用蛋白质印迹法时，需每孔 27,000 个细胞才能获得最低化学发光信号。因此，在该实验条件下，RET 总蛋白均相时间分辨荧光检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 8 倍。


assay-validation-ret-total-7（图示：RET 总蛋白检测与蛋白质印迹法比较验证）


简化通路

RET 信号通路

RET 可被胶质细胞源性神经营养因子家族配体（GFL）激活，该家族配体包括胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）、神经营养素（NRTN）、肌萎缩相关蛋白（ARTN）和 Persephin（PSPN）。配体与 GDNF 家族受体 α 共受体（GFRα1/2/3/4）结合后，会触发其与 RET 形成复合物，进而导致 RET 发生二聚化，并在细胞内多个酪氨酸残基上发生自身磷酸化。磷酸化的酪氨酸残基可作为多种衔接蛋白的结合位点，这些衔接蛋白会激活下游信号通路（如 MAPK、PI3K/AKT、STAT3 等），而这些通路对于细胞存活、分化、增殖和迁移至关重要。


phospho-pathway-ret-total（图示：RET 总蛋白相关信号通路）


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