产品概述

这款 HTRF 细胞水平检测试剂盒可便捷、准确地检测 Tyr15 位点磷酸化的周期蛋白依赖性激酶 1（Phospho-CDK1，Tyr15）。周期蛋白依赖性激酶 1（CDK1）是协调哺乳动物细胞周期进程的 CDK 亚家族成员（还包括 CDK2、CDK4 和 CDK6）。CDK1 是 M 期促进因子（一种蛋白激酶）的催化亚基，可诱导细胞进入有丝分裂。它通过与多种间期周期蛋白（周期蛋白 A、周期蛋白 B）结合，推动 G2-M 期转换，并调控 G1 期进程及 G1-S 期转换。Wee1 和 Myt1 蛋白激酶可催化 CDK1 的 Thr14 和 Tyr15 位点磷酸化，从而抑制 CDK1 活性；而 cdc25 磷酸酶则负责去除这两个位点的磷酸基团，进而激活 CDK1。Tyr15 位点的 CDK1 抑制性磷酸化，对维持基因组完整性、防止 S 期 DNA 损伤至关重要。因此，Wee1/Cdc25A 轴是极具吸引力的癌症治疗靶点，可能为致敏 CDK1 过度活跃的癌细胞提供独特思路。

工作原理

磷酸化 CDK1（Tyr15）检测原理

该检测专门针对 Tyr15 位点磷酸化的 CDK1 进行定量。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，它完全基于微孔板操作，无需凝胶、电泳或转膜步骤。检测采用两种抗体：一种标记供体荧光团，另一种标记受体荧光团。第一种抗体特异性结合蛋白上的磷酸化基序，第二种抗体则不依赖蛋白的磷酸化状态识别目标蛋白。蛋白磷酸化会促使两种标记抗体形成免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团近距离接触，进而产生荧光共振能量转移（FRET）信号。信号强度与样本中磷酸化蛋白的浓度直接成正比，且该检测采用免洗涤格式，可便捷评估蛋白的磷酸化状态。（图示：human-mouse-phospho-CDK1-Tyr15-detection-kit，磷酸化 CDK1（Tyr15）检测原理相关图示）

磷酸化 CDK1（Tyr15）双板检测方案

双板方案流程如下：先在 96 孔板中培养细胞，裂解后将裂解液转移至 384 孔低体积检测板，再加入磷酸化 CDK1（Tyr15）HTRF 检测试剂。该方案可监测细胞的活力和融合度。（图示：human-mouse-phospho-CDK1-Tyr15-detection-kit，磷酸化 CDK1（Tyr15）双板检测方案相关图示）

磷酸化 CDK1（Tyr15）单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测磷酸化 CDK1（Tyr15）可在单个微孔板中完成，该板可同时用于细胞培养、刺激处理和裂解。无需洗涤步骤，此方案专为高通量筛选（HTS）设计，可实现实验微型化，同时保持稳定可靠的 HTRF 检测质量。（图示：human-mouse-phospho-CDK1-Tyr15-detection-kit，磷酸化 CDK1（Tyr15）单板检测方案相关图示）

检测详情

羟基脲对磷酸化 CDK1（Tyr15）的调控作用验证

将 HeLa 细胞接种到 96 孔板（每孔 50,000 个细胞），培养 6 小时后，用不同浓度的羟基脲（单链断裂诱导剂）过夜处理。细胞裂解后，取 16 微升裂解液转移至 384 孔低体积白色微孔板，加入 4 微升 HTRF 磷酸化 CDK1（Tyr15）或总 CDK1 检测抗体，孵育过夜后记录 HTRF 信号。结果符合预期：羟基脲以剂量依赖性方式诱导 Tyr15 位点的 CDK1 磷酸化水平升高，而蛋白表达水平未受该处理影响。（图示：human-mouse-phospho-CDK1-Tyr15-detection-kit，羟基脲调控相关检测验证图示）

Wee1/Myt1 抑制剂对磷酸化 CDK1（Tyr15）的调控作用验证

将 HeLa 细胞接种到 96 孔板（每孔 50,000 个细胞），培养 24 小时后，用 Wee1 激酶抑制剂 Adavosertib 和 PD0166285 处理 2 小时。细胞裂解后，取 16 微升裂解液转移至 384 孔低体积白色微孔板，加入 4 微升 HTRF 磷酸化 CDK1（Tyr15）或总 CDK1 检测抗体，孵育过夜后记录 HTRF 信号。结果符合预期：两种 Wee1 激酶抑制剂均以剂量依赖性方式降低 Tyr15 位点的 CDK1 磷酸化水平，而蛋白表达水平未受这些处理影响。（图示：human-mouse-phospho-CDK1-Tyr15-detection-kit，Wee1/Myt1 抑制剂调控相关检测验证图示）

siRNA 敲低实验验证磷酸化 CDK1（Tyr15）检测的特异性

将 HeLa 细胞接种到 96 孔板（每孔 5,000 个细胞），培养 24 小时后，转染针对 CDK1、CDK2、CDK3、CDK4、CDK5 或 CDK6 的特异性 siRNA，同时设置阴性对照 siRNA。孵育 48 小时后裂解细胞，取 16 微升裂解液转移至 384 孔低体积白色微孔板，加入 4 微升 HTRF 磷酸化 CDK1（Tyr15）检测抗体，孵育过夜后记录 HTRF 信号。结果显示：与转染阴性对照 siRNA 的细胞相比，转染 CDK1 siRNA 的细胞信号下降 68%；而敲低 CDK2、CDK3、CDK4、CDK5 或 CDK6 均未导致信号下降，表明该 HTRF 检测对 CDK1 磷酸化具有特异性，不会与其他细胞周期 CDK 家族成员发生交叉反应。（图示：human-mouse-phospho-CDK1-Tyr15-detection-kit，siRNA 敲低特异性验证相关图示）

不同细胞系中磷酸化 CDK1（Tyr15）水平的检测

将贴壁细胞（人源 HeLa、MCF7，鼠源 Neuro 2A）或悬浮细胞（如人源 THP1）以每孔 50,000 个细胞的密度接种到 96 孔板，培养 24 小时后，用添加补剂的裂解缓冲液裂解细胞。取 16 微升裂解液转移至 384 孔低体积白色微孔板，加入 4 微升 HTRF 磷酸化 CDK1（Tyr15）检测试剂，孵育过夜后记录 HTRF 信号。结果显示：该 HTRF 检测可在表达不同水平目标蛋白的多种细胞模型中，有效检测到磷酸化 CDK1（Tyr15）。（图示：human-mouse-phospho-CDK1-Tyr15-detection-kit，不同细胞系检测相关图示）

磷酸化 CDK1（Tyr15）HTRF 检测与 Western Blot 的对比

将 HeLa 细胞接种到 T175 培养瓶，在完全培养基中于 37°C、5% 二氧化碳条件下培养 48 小时。加入 3 毫升添加补剂的 1 号裂解缓冲液（1X），室温温和振荡 30 分钟裂解细胞。用添加补剂的裂解缓冲液对细胞裂解液进行系列稀释，取 16 微升各稀释液转移至低体积白色微孔板，加入 4 微升 HTRF 磷酸化 CDK1（Tyr15）检测试剂。同时取等量裂解液进行 Western Blot 检测，进行平行对比。结果显示：使用 HTRF 检测时，每孔仅需 1250 个细胞即可检测到显著信号；而 Western Blot 需 10,000 个细胞才能获得最低化学发光信号。因此，在该实验条件下，HTRF 检测的灵敏度是 Western Blot 的 8 倍。（图示：human-mouse-phospho-CDK1-Tyr15-detection-kit，与 Western Blot 对比相关图示）

简化通路

磷酸化 CDK1 在细胞分裂周期中的作用

CDK1（周期蛋白依赖性激酶 1）是协调哺乳动物细胞周期进程的 CDK 亚家族成员（还包括 CDK2、CDK4 和 CDK6）。生长因子等有丝分裂信号通过诱导周期蛋白 D 合成，触发细胞进入细胞周期 G1 期，形成活性 CDK4/6 - 周期蛋白 D 复合物。CDK4 和 CDK6 使视网膜母细胞瘤蛋白（RB）发生单磷酸化，此时 RB 仍与转录因子 E2F 结合，但部分基因（如周期蛋白 E）可被转录。在 G1 期晚期和 S 期早期，周期蛋白 E 与 CDK2 结合并激活 CDK2，进而磷酸化 RB 上的额外位点，导致 RB 完全失活。由此诱导 S 期进展所需的 E2F 应答基因（如周期蛋白 A）表达，周期蛋白 A 随后与 CDK2 结合形成周期蛋白 A/CDK2 复合物。激活的 CDK2 最终磷酸化 Cdc25B 和 Cdc25C 磷酸酶，这些磷酸酶进而激活 CDK1，为细胞分裂周期中 G2 期和 M 期的进展（中心体成熟与分离、染色体浓缩、核膜破裂后进入有丝分裂）提供支持。（图示：phospho-pathway-Phospho-CDK1-y15.svg，磷酸化 CDK1 信号通路相关图示）

产品规格

其他规格

• 应用领域（Application）：细胞信号传导（Cell Signaling）
• 品牌（Brand）：HTRF
• 检测方式（Detection Modality）：HTRF（均相时间分辨荧光技术）
• 裂解缓冲液兼容性（Lysis Buffer Compatibility）：1 号裂解缓冲液、2 号裂解缓冲液、3 号裂解缓冲液、4 号裂解缓冲液
• 分子修饰（Molecular Modification）：磷酸化（Phosphorylation）
• 产品类别（Product Group）：试剂盒（Kit）
• 样本体积（Sample Volume）：16 微升（16 µL）
• 运输条件（Shipping Conditions）：干冰运输（Shipped in Dry Ice）
• 靶标类别（Target Class）：磷酸化蛋白（Phosphoproteins）
• 靶标物种（Target Species）：人（Human）、小鼠（Mouse）
• 技术平台（Technology）：TR-FRET（时间分辨荧光共振能量转移技术）
• 单位规格（Unit Size）：10000 个检测点（10,000 assay points）