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HTRF STAT6 P-Y641 KIT - 500 PTS 磷酸化STAT6(Y641)检测试剂盒 - 500测试

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品牌： Revvity

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概述


本细胞检测试剂盒旨在监测 STAT6 在酪氨酸 641（Tyr641）位点的磷酸化，这是其激活的标志性事件。


STAT6 是一种转录因子，主要由白细胞介素 4（IL4）受体激活，也可由 IL3、IL13 或干扰素 α（IFNα）受体激活。Janus 激酶使 STAT6 的酪氨酸 641 位点磷酸化，进而形成同源二聚体或与 STAT2 形成异源二聚体。最终，激活的 STAT6 转运至细胞核，介导细胞因子诱导的基因表达。


工作原理

磷酸化 STAT6（Tyr641）检测原理

磷酸化 STAT6（Tyr641）检测用于测定在 Tyr641 位点发生磷酸化的 STAT6。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。磷酸化 STAT6（Tyr641）检测采用两种标记抗体：一种标记供体荧光团，另一种标记受体荧光团。第一种抗体经筛选可特异性结合蛋白质上的磷酸化基序，第二种抗体则能识别该蛋白质，且不受其磷酸化状态影响。蛋白质磷酸化会促使形成包含两种标记抗体的免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生 FRET 信号。信号强度与样品中磷酸化蛋白质的浓度直接成正比，为在免洗涤检测格式中评估蛋白质磷酸化状态提供了便捷方式。


1phospho-how-it-works-phospho-stat6-y641-assay-principle.svg（磷酸化 STAT6（Tyr641）检测原理示意图）

磷酸化 STAT6（Tyr641）双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，然后裂解细胞，再将裂解物转移至 384 孔低体积检测板中，最后加入磷酸化 STAT6（Tyr641）HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。


HTRF 总 BRD2 检测的双板方案（示意图参考）

磷酸化 STAT6（Tyr641）单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测磷酸化 STAT6（Tyr641）可在单个培养板中完成，该培养板同时用于细胞培养、刺激和裂解。无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案可实现小型化，同时保持稳定的 HTRF 检测质量。


HTRF 总 BRD2 检测的单板方案（示意图参考）


检测验证

STAT6 Tyr641 磷酸化在多种细胞模型中的评估

将多种人类细胞系（包括贴壁的 HeLa 细胞和悬浮细胞，如 TF1、U937 和 THP1 细胞）以 100,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔微孔板中，然后用 5ng/mL 的人 IL4 刺激 20 分钟。用补充的裂解缓冲液裂解细胞后，将 16µL 裂解物转移至 384 孔低体积白色微孔板中，再加入 4µL HTRF 磷酸化 STAT6（Tyr641）检测试剂。孵育过夜后记录 HTRF 信号。


4assay-validation-stat6-phospho-y641-1.svg（验证示意图 1）

THP1 细胞中磷酸化 STAT6（Tyr641）的药理学验证

将 THP1 细胞以不同密度接种到 96 孔微孔板中，然后用不同浓度的人 IL4 刺激 20 分钟。按照双板检测方案，将 16µL 裂解物转移至 384 孔低体积白色微孔板中，再加入 4µL HTRF 磷酸化 STAT6（Tyr641）检测试剂。孵育过夜后记录 HTRF 信号。


5assay-validation-stat6-phospho-y641-2.svg（验证示意图 2）

干扰素 α 诱导的 STAT6 磷酸化剂量反应

将 THP1 细胞以不同密度接种到 96 孔微孔板中，然后用不同浓度的人 IFNα 刺激 20 分钟。按照双板检测方案，将 16µL 裂解物转移至 384 孔低体积白色微孔板中，再加入 4µL HTRF 磷酸化 STAT6（Tyr641）检测试剂。孵育过夜后记录 HTRF 信号。


6assay-validation-stat6-phospho-y641-3.svg（验证示意图 3）

HTRF 磷酸化 STAT6 细胞检测与蛋白质印迹法的比较

将人 HeLa 细胞接种到 T175 培养瓶中，在 37°C、5% CO₂条件下培养至汇合。然后用 50ng/mL 的 IL4 处理细胞 20 分钟，随后裂解。用补充的裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，将 16µL 各稀释液转移至低体积白色微孔板中，再加入 4µL HTRF 磷酸化 STAT6 检测试剂。取等量裂解物，采用 HTRF 与蛋白质印迹法进行平行比较。使用 HTRF 磷酸化 STAT6（Tyr641）检测时，每孔 5,000 个细胞即可检测到信号，而蛋白质印迹法（ECL 检测）则需要 40,000 个细胞。结果表明，HTRF 磷酸化 STAT6 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 8 倍。


7assay-validation-stat6-phospho-y641-4.svg（比较示意图）


简化通路

STAT6 的功能与调控

细胞因子和生长因子通过受体相关激酶 JAK 使 STAT6 磷酸化。磷酸化后的 STAT6 形成同源二聚体或异源二聚体，并转运至细胞核，介导细胞因子诱导的基因表达。白细胞介素 4 是触发 STAT6 酪氨酸 641 位点磷酸化的主要细胞因子，可诱导 BCL2L1/BCL-X (L) 的表达，而该基因与 IL4 的抗凋亡活性相关。此外，TBK1 介导的 STAT6 磷酸化与 STING 通路相关，在病毒感染引发的先天免疫中发挥作用。


8phospho-pathway-stat6-phospho-y641-kit-64at6peghy.svg（通路示意图）


规格


其他规格

  • 应用：细胞信号传导
  • 品牌：HTRF
  • 检测方式：HTRF
  • 兼容的裂解缓冲液：3 号裂解缓冲液、4 号裂解缓冲液、5 号裂解缓冲液
  • 分子修饰：磷酸化
  • 产品类别：试剂盒
  • 样品体积：16µL
  • 运输条件：干冰运输
  • 靶标类别：磷酸化蛋白
  • 靶标物种：人类
  • 技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
  • 治疗领域：感染性疾病、肿瘤与炎症
  • 单位规格：500 个检测点


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cSystemFont, "Segoe UI", "PingFang SC", "Hiragino Sans GB", "Microsoft YaHei", "Helvetica Neue", Helvetica, Arial, sans-serif; text-wrap-mode: wrap; background-color: rgb(255, 255, 255);">采用 HTRF 总 SMARCA2 检测试剂盒，在 A549 细胞（肺癌细胞系）和 HAP1 细胞（野生型）中检测 SMARCA2 的表达水平；同时，采用 HTRF 总 SMARCA4 检测试剂盒检测上述细胞中 SMARCA4 的表达水平。实验前已对细胞密度进行优化，以确保 HTRF 检测信号处于试剂盒的动态检测范围内（相关数据未展示）。
将不同细胞系以 2×10⁵个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔培养板中，在 37°C、5% 二氧化碳（CO₂）条件下孵育 24 小时。移除培养基后，用 50 微升（µL）1 倍浓度的 1 号补充型裂解缓冲液在室温下轻柔振荡裂解细胞 30 分钟。随后，取 16 微升细胞裂解液转移至小体积白色微孔板中，再加入 4 微升预混合的检测试剂。在室温下孵育过夜后，记录 HTRF 信号。
结果显示：在 A549 细胞中检测到 SMARCA2 的低水平表达，而 SMARCA4 的表达水平与非特异性信号（虚线标注）相当，表明该细胞中 SMARCA4 不表达，这与文献报道一致（Hoffman, G. R. 等，《美国国家科学院院刊》，2014 年）。
此外，HAP1 细胞中 SMARCA2 的表达水平与非特异性信号（虚线标注）相当，表明该细胞中 SMARCA2 不表达；而正如预期，在 HAP1 细胞中可检测到较高水平的 SMARCA4 表达。
上述结果表明，尽管 SMARCA2 与 SMARCA4 的序列同源性超过 70%，HTRF 总 SMARCA2 检测试剂盒仍对 SMARCA2 具有特异性。
所用细胞系目录编号（购自 Horizon Discovery）：HAP1 野生型 #C631。
（图示标注：assay-validation-smarca2-total-pharmaco-1-1.svg、assay-validation-smarca2-total-pharmaco-1-2.svg，即 “利用相关细胞系验证 HTRF 总 SMARCA2 检测特异性的结果图”）

在多种人源细胞系中的验证

将贴壁生长的人源细胞系 HeLa 细胞（宫颈癌细胞系）、HEK293 细胞（肾细胞系）和 A549 细胞（肺癌细胞系）以 2×10⁵个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔培养板中，在 37°C、5% 二氧化碳条件下孵育 24 小时。移除培养基后，用 50 微升 1 倍浓度的 1 号补充型裂解缓冲液在室温下轻柔振荡裂解细胞 30 分钟。
将悬浮生长的人源细胞系 HEL92.1.7 细胞（红白血病细胞系）和 MOLT-4 细胞（T 淋巴细胞白血病细胞系）以 2×10⁵个细胞 / 孔的密度、30 微升体系接种到 96 孔板中，在 37°C、5% 二氧化碳条件下孵育 1 小时，随后用 10 微升 4 倍浓度的 1 号补充型裂解缓冲液在室温下轻柔振荡裂解细胞 30 分钟。
采用 HTRF 总 SMARCA2 检测试剂盒检测 SMARCA2 的表达水平：简要步骤为，取 16 微升细胞裂解液转移至小体积白色微孔板中，再加入 4 微升预混合的 HTRF 检测试剂。在室温下孵育过夜后，记录 HTRF 信号。虚线代表非特异性 HTRF 信号。注：实验前已对细胞密度进行优化，以确保 HTRF 检测信号处于试剂盒的动态检测范围内（相关数据未展示）。
结果显示，HTRF 总 SMARCA2 检测可有效检测不同细胞模型中内源性 SMARCA2 的表达（这些细胞模型中 SMARCA2 的表达水平存在差异）。
（图示标注：assay-validation-smarca2-total-pharmaco-2.svg，即 “多种人源细胞系中 SMARCA2 检测结果图”）

PROTAC 诱导的 SMARCA2 降解实验

将 HEL92.1.7 细胞以 1×10⁵个细胞 / 30 微升体系接种到 96 孔板中，用浓度递增的 PROTAC 化合物 ACBI1、AU-15330 处理细胞，同时以 PROTAC 化合物 ARV-471（雌激素受体 PROTAC）作为无关阴性对照。孵育过夜后，用 10 微升 4 倍浓度的 1 号补充型裂解缓冲液在室温下轻柔振荡裂解细胞 30 分钟。细胞裂解后，取 16 微升裂解液转移至 384 孔小体积白色微孔板中，加入 4 微升 HTRF 总 SMARCA2 检测抗体。孵育过夜后，记录 HTRF 信号。
结果显示：两种 SMARCA2 PROTAC 降解剂处理细胞后，SMARCA2 蛋白水平呈剂量依赖性下降；而在 ARV-471 对照处理组中，SMARCA2 的表达水平及 ATP 水平均保持稳定。上述结果表明，PROTAC 可诱导 SMARCA2 的特异性降解，其 DC50 * 值处于纳摩尔（nM）级，与预期一致（Farnabay, W. 等，《自然化学生物学》，2019 年；Xiao, L. 等，《自然》，2022 年）。
* 注：DC50 指使 50% 的靶蛋白发生降解时所需降解剂的浓度。
（图示标注：assay-validation-smarca2-total-pharmaco-3-1.svg、assay-validation-smarca2-total-pharmaco-3-2.svg，即 “PROTAC 诱导 SMARCA2 降解实验结果图”）

PROTAC 对 SMARCA2 与 SMARCA4 的作用谱分析

（图示标注：assay-validation-smarca2-total-pharmaco-4-1.svg、assay-validation-smarca2-total-pharmaco-4-2.svg，即 “PROTAC 对 SMARCA2 与 SMARCA4 作用谱分析相关结果图”）
将 HEL92.1.7 细胞以 1×10⁵个细胞 / 30 微升体系接种到 96 孔板中，用浓度递增的 PROTAC 化合物 ACBI1、AU-15330 处理细胞。孵育过夜后，用 10 微升 4 倍浓度的 1 号补充型裂解缓冲液在室温下轻柔振荡裂解细胞 30 分钟。细胞裂解后，取 16 微升裂解液转移至 384 孔小体积白色微孔板中，加入 4 微升 HTRF 检测抗体（分别使用总 SMARCA2 或总 SMARCA4 检测试剂）。孵育过夜后，记录 HTRF 信号。
结果显示：ACBI1 和 AU-15330 可诱导 SMARCA2 和 SMARCA4 的水平呈剂量依赖性下降；在相同实验条件下，ATP 水平保持稳定（相关数据未展示）。上述结果与 Farnabay, W. 等（《自然化学生物学》，2019 年）及 Xiao, L. 等（《自然》，2022 年）的研究结论一致。
ACBI1 的已知靶向蛋白为 SMARCA2、SMARCA4、PBRM1，E3 连接酶配体为 VHL 配体，对总 SMARCA2 的 DC50（纳摩尔）为 224，对总 SMARCA4 的 DC50（纳摩尔）为 231；AU-15330 的已知靶向蛋白为 SMARCA2、SMARCA4、PBRM1，E3 连接酶配体为 VHL 配体，对总 SMARCA2 的 DC50（纳摩尔）为 242，对总 SMARCA4 的 DC50（纳摩尔）为 620。

HTRF 总 SMARCA2 检测与蛋白质印迹法（Western Blot）的对比

将 HEL92.1.7 细胞在含完全培养基的 T175 培养瓶中培养，置于 37°C、5% 二氧化碳环境下。孵育 24 小时后，移除培养基，用 3 毫升 1 倍浓度的 1 号补充型裂解缓冲液在室温下轻柔振荡裂解细胞 30 分钟。
用 1 号补充型裂解缓冲液对细胞裂解液进行系列稀释，取 16 微升各稀释度的裂解液转移至小体积白色微孔板中，再加入 4 微升 HTRF 总 SMARCA2 检测试剂。
取等量裂解液进行蛋白质印迹实验，与 HTRF 检测结果进行平行对比。
结果显示，在该实验条件下，HTRF 总 SMARCA2 检测的灵敏度与蛋白质印迹法相当。
（图示标注：assay-validation-smarca2-total-pharmaco-5.png，即 “HTRF 总 SMARCA2 检测与 Western Blot 对比结果图”）


简化通路：SMARCA2 信号通路

SMARCA2 与 SMARCA4 是 SWI/SNF 复合物中的催化亚基，参与 DNA 转录和修复过程。SMARCA2 与 SMARCA4 包含 6 个不同的结构域，其中包括 DNA 依赖性 ATP 酶结构域和溴结构域（Bromo 结构域）。溴结构域及组蛋白 H3 第 27 位赖氨酸乙酰化（H3K27ac）水平可调控 DNA 与 SWI/SNF 复合物的结合，而 ATP 酶结构域则负责催化 DNA 双链的解旋。
上述功能会受到多梳抑制复合物 2（PRC2）中 EZH2 催化亚基的拮抗 ——EZH2 可抑制基因转录。当 SMARCA2 或 SMARCA4 功能缺失时，DNA 损伤会加剧，这是因为 PRC2 会持续结合到核小体上，抑制 DNA 修复过程。
（图示标注：phospho-pathway-smarca2.svg，即 “SMARCA2 信号通路示意图”）


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货号：64SMARC2TPEH
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