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HTRF P53 P-S15 KIT - 50K PTS

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概述

这种基于 HTRF 细胞的检测方法能够便捷、准确地定量 Ser15 位点磷酸化的 p53 蛋白。p53 因其在维护基因组完整性方面的作用而被称为 “基因组的守护者”。p53 具有多种抗癌功能机制，通过调控各种靶基因的表达，影响细胞凋亡、衰老、细胞周期调控、生长停滞、基因组稳定性、血管生成抑制以及代谢变化等过程。

工作原理
磷酸化 p53（Ser15）检测原理
磷酸化 p53（Ser15）检测用于测量在 Ser15 位点发生磷酸化的 p53 蛋白。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。磷酸化 p53（Ser15）检测使用两种标记抗体：一种标记有供体荧光团，另一种标记有受体荧光团。第一种抗体经筛选可特异性结合蛋白质上的磷酸化基序，第二种抗体则能识别该蛋白质，且不受其磷酸化状态的影响。蛋白质磷酸化会促使形成包含两种标记抗体的免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生 FRET 信号。该信号强度与样品中磷酸化蛋白的浓度直接成正比，并且提供了一种在无需洗涤的检测格式中评估蛋白质磷酸化状态的方法。

磷酸化 p53（Ser15）双板检测方案
双板方案包括先在 96 孔板中培养细胞，然后进行裂解，接着将裂解物转移到 384 孔小体积检测板中，之后再加入磷酸化 p53（Ser15）HTRF 检测试剂。此方案能够监测细胞的活力和汇合度。

磷酸化 p53（Ser15）单板检测方案
使用 HTRF 试剂检测磷酸化 p53（Ser15）可在单个板中完成，该板可用于细胞培养、刺激和裂解。无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现微型化操作，同时保持稳定的 HTRF 检测质量。

检测验证
在人 MCF - 7 细胞上使用磷酸化和总 p53 检测进行 HTRF 检测与蛋白质印迹法的比较
将人 MCF - 7 细胞以 10⁶个细胞 / 孔的密度接种到 6 孔板中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时。经紫外线（2.1J/cm²）处理 5 分钟后，加入 200µL 裂解缓冲液，在室温下轻轻振荡 30 分钟以裂解细胞。用补充的裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，将 16µL 各稀释液转移到 384 孔小体积白色微孔板中，然后加入 4µL HTRF 磷酸化 p53（Ser15）检测试剂。取等量的裂解物用于蛋白质印迹法与 HTRF 检测的平行比较。结果表明，两种 HTRF p53 检测的灵敏度至少是蛋白质印迹法的 4 倍。

在经新制癌菌素处理的 MCF - 7 乳腺癌细胞上的验证
将人 MCF - 7 细胞以 100,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔板中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时。用不同浓度的新制癌菌素处理 45 分钟后，移除培养基，加入 50µL 裂解缓冲液，在室温下轻轻振荡 30 分钟以裂解细胞。将 16µL 裂解物转移到 384 孔小体积白色微孔板中，并加入 4µL HTRF 磷酸化 p53（Ser15）或总 p53 检测试剂。孵育过夜后记录 HTRF 信号。

在经依托泊苷（凋亡诱导剂）处理的乳腺癌 MCF - 7 细胞上的验证
将人 MCF - 7 细胞以 200,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔板中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时。用不同浓度的依托泊苷处理 3 小时后，移除培养基，加入 50µL 裂解缓冲液，在室温下轻轻振荡 30 分钟以裂解细胞。将 16µL 裂解物转移到 384 孔小体积白色微孔板中，并加入 4µL HTRF 磷酸化 p53（Ser15）或总 p53 检测试剂。孵育过夜后记录 HTRF 信号。

简化通路
p53 的功能与调控
p53 可被多种应激因素激活，包括但不限于 DNA 损伤、氧化应激、渗透压冲击、核糖核苷酸耗竭以及癌基因表达失调等。在应对这些应激时，p53 会发生大量翻译后修饰，包括磷酸化和乙酰化。p53 的磷酸化主要发生在 N 端的 Ser15 位点，这会减弱 p53 与其负调控因子 —— 癌蛋白 MDM2 之间的相互作用。MDM2 通过将 p53 靶向泛素化并使其经蛋白酶体降解来抑制 p53 的积累。该位点的磷酸化会削弱 MDM2 与 p53 的结合能力，从而在 DNA 损伤时促进 p53 的积累和激活。

规格
其他规格
应用领域：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
分子修饰：磷酸化
产品类别：试剂盒
样品体积：16µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷酸蛋白
靶标物种：人
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR - FRET）
治疗领域：肿瘤学与炎症
单位规格：50,000 个检测点

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货号：64P53PEY

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