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HTRF RB P-S807/811 KIT - 500 PTS 磷酸化RB(S807/811)试剂盒–500测试

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概述

这款基于细胞的均相时间分辨荧光检测试剂盒可便捷且准确地定量检测丝氨酸 807/811 位点磷酸化的视网膜母细胞瘤蛋白（Rb）。Rb 属于口袋蛋白家族，是一种肿瘤抑制因子，能够调控细胞周期进程。具有活性的去磷酸化 Rb 会与 E2F 转录因子相互作用并抑制其转录活性，从而阻止细胞周期从 G0 期向 G1 期转换及后续进程。当存在有丝分裂信号时，周期蛋白 D - 细胞周期蛋白依赖性激酶 4/6（cyclin D-CDK4/6）会首先对 Rb 进行磷酸化，随后周期蛋白 E - 细胞周期蛋白依赖性激酶 2（cyclin E-CDK2）继续对其磷酸化，使 Rb 失活；失活后的 Rb 会释放出细胞周期进程所需的 E2F 转录因子。

工作原理

磷酸化 Rb（丝氨酸 807/811 位点）检测原理

磷酸化 Rb（丝氨酸 807/811 位点）检测可对丝氨酸 807/811 位点发生磷酸化的 Rb 进行定量。与蛋白质印迹法不同，该检测为全微孔板检测模式，无需使用凝胶、进行电泳或转膜操作。

磷酸化 Rb（丝氨酸 807/811 位点）检测采用两种标记抗体：一种标记供体荧光团，另一种标记受体荧光团。第一种抗体经筛选，可特异性结合蛋白质上的磷酸化基序；第二种抗体则能不依赖蛋白质的磷酸化状态识别该蛋白质。当蛋白质发生磷酸化时，会形成由这两种标记抗体共同参与的免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团近距离接触，进而产生荧光共振能量转移信号。该信号强度与样本中磷酸化蛋白质的浓度直接成正比，且可通过 “免洗涤” 检测模式评估蛋白质的磷酸化状态。

phospho-rb-ser807-s811-assay-kit-principle（图示：磷酸化 Rb（丝氨酸 807/811 位点）检测原理）

磷酸化 Rb（丝氨酸 807/811 位点）双板检测方案

双板检测方案的流程为：先在 96 孔板中培养细胞，随后进行裂解；将裂解液转移至小体积检测板（均相时间分辨荧光 384 孔小体积板或 96 孔小体积板）后，加入均相时间分辨荧光磷酸化 Rb（丝氨酸 807/811 位点）检测试剂。该方案可实现对细胞存活率和融合度的监测。

phospho-rb-ser807-ser811-cellular-assay-2-plate-assay-protocol（图示：磷酸化 Rb（丝氨酸 807/811 位点）双板检测方案）

磷酸化 Rb（丝氨酸 807/811 位点）单板检测方案

使用均相时间分辨荧光试剂检测磷酸化 Rb（丝氨酸 807/811 位点）时，可在同一块用于细胞培养、刺激和裂解的微孔板中完成检测，无需洗涤步骤。该专为高通量筛选设计的方案，能在实现实验微型化的同时，保持稳定可靠的均相时间分辨荧光检测质量。

phospho-rb-ser807-ser811-1-plate-assay-protocol（图示：磷酸化 Rb（丝氨酸 807/811 位点）单板检测方案）

检测验证

在 HCT-116 细胞中，细胞周期蛋白依赖性激酶 4/6 抑制剂帕博西尼可有效抑制 Rb 丝氨酸 807/811 位点的磷酸化

将 HCT-116 细胞用 50 微升完全培养基，以每孔 50,000 个细胞的密度接种到 96 孔板中，在 37°C、5% 二氧化碳条件下孵育。6 小时后，加入浓度递增的帕博西尼（额外添加 50 微升），处理 19 小时。

移除培养基后，加入 50 微升补充后的裂解缓冲液，在室温下轻柔振荡裂解 30 分钟；取 16 微升裂解液转移至小体积白色微孔板，加入 4 微升预混合的均相时间分辨荧光磷酸化 Rb（丝氨酸 807/811 位点）或总 Rb 检测试剂。孵育 4 小时后，记录均相时间分辨荧光信号。

结果显示：细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK4 和 CDK6）抑制剂帕博西尼，会导致 Rb 丝氨酸 807/811 位点的磷酸化水平显著降低，同时 Rb 总蛋白量也会下降（该结果与 Liu 等人 2017 年发表在《公共科学图书馆》期刊的研究一致）。

assay-validation-rb-phospho-s807-801-1（图示：磷酸化 Rb（丝氨酸 807/811 位点）检测验证 1）

磷酸化 Rb 细胞检测对人源和鼠源细胞系的验证

将 NIH 3T3 细胞、C2C12 细胞和 HCT116 细胞以每孔 100,000 个细胞的密度接种到 96 孔板中。在 37°C、5% 二氧化碳条件下孵育过夜后，移除细胞培养基，向细胞中加入 50 微升裂解缓冲液，轻柔振荡裂解 30 分钟。取 16 微升样本转移至 384 孔小体积板，随后分别加入 4 微升三种 Rb 均相时间分辨荧光检测试剂。孵育 4 小时后，记录信号。

结果显示：两种 Rb 磷酸化均相时间分辨荧光检测均兼容鼠源模型。

assay-validation-rb-phospho-s807-801-2（图示：磷酸化 Rb（丝氨酸 807/811 位点）检测验证 2）

人源 HCT116 细胞中磷酸化 Rb（丝氨酸 807/811 位点）均相时间分辨荧光检测与蛋白质印迹法的比较

将人源 HCT116 细胞在 T175 培养瓶中，于 37°C、5% 二氧化碳条件下培养。当细胞融合度达到 80% 时，裂解细胞并通过离心收集可溶性上清液。对细胞裂解液进行系列稀释，取 16 微升各稀释度裂解液转移至 384 孔小体积白色微孔板，最终加入 Rb 丝氨酸 807/811 位点磷酸化细胞检测试剂盒试剂。

平行对比结果显示：磷酸化 Rb 均相时间分辨荧光检测的灵敏度至少是蛋白质印迹法的 27 倍。

assay-validation-rb-phospho-s807-801-3（图示：磷酸化 Rb（丝氨酸 807/811 位点）检测与蛋白质印迹法比较验证）

简化通路

细胞分裂周期中的视网膜母细胞瘤蛋白（Rb）

分子量为 110 千道尔顿的视网膜母细胞瘤蛋白（Rb）属于口袋蛋白家族，该家族还包括 p107 和 p130 蛋白。

Rb 作为肿瘤抑制因子，可调控细胞周期进程。当 Rb 发生失活突变时，会引发视网膜母细胞瘤 —— 此时视网膜细胞无法正常更新，且会暴露于高剂量致突变紫外线辐射下。

在无有丝分裂信号时，具有活性的去磷酸化 Rb 会结合并抑制 E2F 转录因子，而 E2F 是细胞进入 S 期（DNA 合成期）所必需的。通过维持 E2F 的失活状态，Rb 可使细胞停留在 G1 期，阻止细胞周期继续推进。

当存在有丝分裂信号时，Rb 会被 cyclin D-CDK4/6 依次磷酸化，随后再被 cyclin E-CDK2 磷酸化，最终失活。这一磷酸化过程会促使 E2F 转录因子释放。

最终，E2F 会激活多种基因的转录，如周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶、胸苷激酶和增殖细胞核抗原等 —— 这些基因在 DNA 合成、复制及细胞分裂中发挥关键作用。

pathway-rb-phopsho-s807-811-63adk105peg（图示：Rb（丝氨酸 807/811 位点）磷酸化信号通路）

规格参数

其他规格参数

应用领域：细胞信号通路研究
品牌：均相时间分辨荧光
检测方式：均相时间分辨荧光
裂解缓冲液兼容性：1 号裂解缓冲液、2 号裂解缓冲液、3 号裂解缓冲液、4 号裂解缓冲液、5 号裂解缓冲液
分子修饰类型：磷酸化
产品类别：试剂盒
样本体积：16 微升
运输条件：干冰运输
靶点类别：磷酸化蛋白
靶点物种：人、小鼠
技术平台：时间分辨荧光共振能量转移
治疗领域：肿瘤学与炎症
单位规格：500 次检测

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货号：64RBS807PEG

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