产品概述

Total-SMAD4 细胞检测试剂盒旨在监测 SMAD4 的表达水平，无论其处于磷酸化还是非磷酸化状态。该试剂盒与我们的磷酸化 SMAD4 试剂盒兼容，可从单个样本中同时分析磷酸化蛋白和总蛋白，从而更精准地解读 TGF-ß 信号通路活性。

工作原理

Total-SMAD4 检测原理

Total-SMAD4 检测可定量细胞裂解液中 SMAD4 的表达水平。与 Western Blot 不同，该检测全程基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。检测采用两种标记抗体：一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。两种抗体均对 SMAD4 上的不同表位具有高特异性。当细胞提取物中存在 SMAD4 时，加入这些偶联抗体后，供体荧光团与受体荧光团会近距离接触，进而产生荧光共振能量转移（FRET）信号。信号强度与样本中 SMAD4 的浓度直接成正比，且该检测为无洗涤格式，可快速评估蛋白表达水平。（图示：phospho-how-it-works-smad4-total-assay-principle，Total-SMAD4 检测原理相关图示）

Total-SMAD4 双板检测方案

双板方案流程：先在 96 孔板中培养细胞，裂解后将裂解液转移至 384 孔低体积检测板，再加入 Total-SMAD4 HTRF 检测试剂。该方案可同步监测细胞的存活率和汇合度。（图示：phospho-how-it-works-smad4-total-assay-protocol-1，Total-SMAD4 双板检测方案相关图示）

Total-SMAD4 单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测总 SMAD4 可在单个微孔板中完成，该板可同时用于细胞培养、刺激和裂解，全程无需洗涤步骤。此方案为高通量筛选（HTS）设计，可实现微型化检测，同时保持稳定的 HTRF 检测质量。（图示：phospho-how-it-works-smad4-total-assay-protocol-2，Total-SMAD4 单板检测方案相关图示）

检测验证

Total-SMAD4 细胞系兼容性

选择 HeLa 和 HAPI 细胞系验证人源兼容性，NIH 3T3 细胞系验证小鼠源兼容性。将 2.5×10⁴、5×10⁴和 1×10⁵个不同细胞系的细胞接种到 96 孔培养板中，37°C、5% 二氧化碳条件下孵育 48 小时后，去除培养基并向每孔加入 50 微升裂解缓冲液，温和振荡裂解 30 分钟。取 16 微升纯样本转移至 384 孔小体积板，加入 4 微升 Total-SMAD4 HTRF 检测试剂，过夜记录信号。该数据可帮助为不同细胞系选择更合适的细胞密度，且 Total-SMAD4 HTRF 检测可同时检测人源和小鼠源 SMAD4 蛋白。（图示：assay-validation-smad4-total，Total-SMAD4 细胞系兼容性相关图示）

Total-SMAD4 检测特异性

将 HAPI 野生型细胞以 2.5×10⁴个 / 孔接种到 96 孔板中，37°C、5% 二氧化碳条件下过夜孵育后，用 25 nM 靶向 SMAD2、SMAD3、SMAD4 的 ON-TARGET plus 小干扰 RNA（Horizon Discovery）或非靶向小干扰 RNA（作为对照）处理细胞。过夜孵育后更换为完全培养基，继续孵育 24 小时。将 HAPI SMAD4 敲除细胞（Horizon Discovery）以 2.5×10⁴个 / 孔接种，孵育 4 天。孵育结束后，用 50 微升添加补剂的 4 号裂解缓冲液（1X）裂解细胞，取 16 微升裂解液转移至低体积白色微孔板，加入 4 微升预混合的 HTRF Total-SMAD4 检测抗体，室温过夜孵育后记录 HTRF 信号。结果显示：SMAD4 小干扰 RNA 处理后，Total-SMAD4 信号显著下调，与非靶向小干扰 RNA 转染细胞相比信号下降 50%；而 HAPI SMAD4 敲除细胞裂解液中未检测到信号。此外，SMAD2 或 SMAD3 小干扰 RNA 处理后的细胞信号无下降，证明试剂盒具有特异性。通过我们的 HTRF Total-SMAD2 和 SMAD3 检测试剂盒验证，SMAD2 和 SMAD3 的信号分别下降 60% 和 66%，确认其敲低效果。（图示：assay-validation-smad4-total-2、assay-validation-smad4-total-3、assay-validation-smad4-total-4，Total-SMAD4 检测特异性相关图示）

HTRF Total-SMAD4 与 Western Blot 对比

HAPI 细胞在 T175 培养瓶中用完全培养基于 37°C、5% 二氧化碳条件下培养至 80% 汇合度，用 3 毫升添加补剂的 4 号裂解缓冲液（1X）室温温和振荡裂解 30 分钟。用添加补剂的 4 号裂解缓冲液（1X）对细胞裂解液进行系列稀释，取 16 微升纯样本及各稀释液转移至 384 孔小体积微孔板，加入 4 微升 HTRF Total-SMAD4 检测试剂，过夜记录信号。取等量裂解液进行凝胶电泳，与 HTRF 检测结果进行平行对比。结果显示：在该实验条件下，HTRF Total-SMAD4 检测的灵敏度至少是 Western Blot 的 16 倍。（图示：assay-validation-smad4-total-5，HTRF 与 Western Blot 对比相关图示）

简化通路

TGF-ß 信号通路

TGF-ß 信号通过 TßRI 和 TßRII 复合物介导，该复合物通过磷酸化激活细胞内的 SMAD3 和 SMAD2。TGF-ß 配体与 TßRII 结合后，会招募 TßRI 形成配体 - 受体复合物；TßRII 发生自身磷酸化，随后转磷酸化激活 TßRI；激活的 TßRI 进而磷酸化 SMAD2 和 SMAD3，使其能够与苏氨酸 277 磷酸化的 SMAD4 形成寡聚体。该三聚体复合物随后转运至细胞核，与共激活因子和共抑制因子共同作为转录因子，调控参与细胞生长、凋亡、增殖、迁移、分化，以及细胞外基质重塑和免疫 / 炎症反应的多个基因表达。抑制性 SMAD6 和 SMAD7 参与该通路的反馈抑制。（图示：pathway-smad4-total，TGF-ß 信号通路相关图示）

产品规格

其他规格

• 应用领域：Cell Signaling（细胞信号传导）
• 兼容自动化：是（Automation Compatible: Yes）
• 品牌：HTRF
• 检测方式：HTRF
• 裂解缓冲液兼容性：1 号裂解缓冲液、2 号裂解缓冲液、3 号裂解缓冲液、4 号裂解缓冲液、5 号裂解缓冲液
• 分子修饰：总蛋白（Molecular Modification: Total）
• 产品类别：Kit
• 样本体积：16 µL
• 运输条件：干冰运输
• 靶标类别：Phosphoproteins（磷酸化蛋白）
• 靶标物种：人、小鼠
• 技术平台：TR-FRET
• 治疗领域：Cardiovascular、Metabolism/Diabetes、NASH/Fibrosis、Oncology & Inflammation
• 单位规格：500 assay points