抗 HA - 铽穴状化合物单克隆抗体为 IgG2b 型,针对十二氨基酸肽序列 CYPYDVPDYASL 制备并标记铽。可识别流感病毒血凝素表位 YPYDVPDYA,该表位已广泛用作表达载体中的通用表位标签。该试剂适用于生化和细胞水平的多种相互作用研究,包括蛋白 / 蛋白、蛋白 / 肽、蛋白 / DNA、蛋白 / RNA、蛋白 / 碳水化合物、受体 / 配体相互作用。HTRF 技术可检测的亲和力常数范围广泛,涵盖皮摩尔至低毫摩尔级别。(标注:htrf mab anti ha-tb cryptate,对应 “抗 HA - 铽穴状化合物单克隆抗体检测原理示意图”)
在 HTRF 相互作用检测中,一个结合伴侣标记供体,另一个标记受体。信号强度与两个伴侣的结合程度成正比。示例流程:抗 HA - 铽穴状化合物单克隆抗体与 HA 标签标记的结合伴侣 A 结合,结合伴侣 B 与标记 HTRF 受体的特异性抗体结合。结合伴侣 B 也可进行生物素化、标签标记、Fc 融合修饰,此时需使用相应的 HTRF 试剂标记受体进行检测。
以 20 微升最终反应体积检测 HA 标签标记的结合伴侣 A 与非标记结合伴侣 B 的相互作用为例:加入两种结合伴侣(10 微升),孵育后加入抗 HA - 铽穴状化合物单克隆抗体(5 微升)和标记受体的抗结合伴侣 B 抗体(5 微升),孵育后读取信号。结合伴侣 B 也可进行生物素化、标签标记、Fc 融合修饰或直接标记,此时需使用相应的 HTRF 试剂标记受体进行检测。(标注:htrf mab anti ha-tb cryptate,对应 “抗 HA - 铽穴状化合物单克隆抗体检测流程示意图”)
每孔平均偶联物量反映总生物材料含量,优先使用活性部分含量而非总偶联物量。铽穴状化合物和 d2 偶联物的总偶联物量等于活性部分含量;XL665 标记物的总偶联物量因摩尔比不同而异,但活性部分含量恒定,基于订购的检测次数确定。
铽穴状化合物偶联物浓度需避免过高导致读数仪饱和及背景过高,多数情况下 1-5 纳摩尔浓度适宜,在兼容 HTRF 的读数仪上 620 纳米处可产生 20,000-80,000 计数 / 秒。XL665 偶联物浓度需尽可能与检测对应物匹配,确保最大数量的生物分子被 XL665 受体标记。检测 20 纳摩尔浓度的标记分子时,抗标签 - XL665 浓度应相当或更高。