‘’H‘’TR‘’F‘’ 人 / 小鼠 NRF2 检测试剂盒可监测多种细胞中内源性 NRF2 的表达。
活性氧（ROS）的过量产生会在细胞中引发氧化应激。NRF2 受 KEAP1 调控。在细胞应激状态下，NRF2 发生磷酸化，从而从 KEAP1 蛋白上释放出来。随后，NRF2 转移到细胞核内。Nrf2 转录因子会激活多种细胞保护基因的转录，包括与癌症和神经退行性疾病（NDD）防护相关的 p62SQSTM1。
HTRF 人 / 小鼠总 NRF2 检测可定量细胞裂解物中 NRF2 的表达水平。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。人总 NRF2 检测使用两种标记抗体，一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。两种抗体均对该蛋白上的特定表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在 NRF2 时，加入这些偶联物会使供体荧光团与受体荧光团接近，从而产生 FRET 信号。其强度与样品中蛋白质的浓度直接成正比，且无需洗涤步骤即可评估蛋白质的表达水平。
双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，然后进行裂解，接着将裂解物转移到 384 孔小体积检测板中，之后再加入人 / 小鼠总 NRF2 HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞活力和汇合度。
使用 HTRF 试剂检测人 NRF2 可在单个板中完成，该板可用于细胞培养、刺激和裂解。无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现小型化，同时保持稳定的 HTRF 质量。
将 Hep-G2 细胞以 200,000 个 / 孔的密度接种到 96 孔培养处理板中，使用完全培养基，在 37°C、5% CO₂条件下孵育过夜。用不同浓度的 tBHQ、Ki696 和毒胡萝卜素在 37°C、5% CO₂条件下处理细胞 16 小时，然后用 50µl 的 1X 补充裂解缓冲液 #1 在室温下轻轻振荡裂解 30 分钟。
细胞裂解后，将 16µL 裂解物转移到 384 孔小体积白色微孔板中，并加入 4µL HTRF 总 NRF2 检测试剂。在室温下孵育 18 小时后记录 HTRF 信号。
正如预期的那样，这些化合物诱导 NRF2 从 Keap1 上释放，NRF2 信号水平呈剂量依赖性增加，且具有不同的半数有效浓度（EC50）：Ki696 为 38 nM，毒胡萝卜素为 0.3 µM，tBHQ 为 29 µM。
将贴壁的人源和鼠源细胞（Hep-G2、HEK-293、HAP1 和 NIH 3T3）以 100,000 或 200,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔微孔板中。孵育 24 小时后，用 tBHQ 在 37°C 条件下处理细胞 16 小时，然后用补充裂解缓冲液 #1 在室温下轻轻振荡裂解细胞。接下来，将 16µL 裂解物转移到 384 孔小体积白色微孔板中，然后加入 4µL HTRF 总 NRF2 检测试剂。孵育过夜后记录 HTRF 信号。
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将 RAW264.7 细胞和 NIH3T3 细胞以 50 µL 的体积接种到 96 孔板中（分别为 200,000 个细胞 / 孔和 100,000 个细胞 / 孔），使用完全培养基培养并过夜孵育。用不同浓度的环二腺苷酸（c-di-AMP）类似物 ADU-S100（50 µL）刺激细胞 1 小时。处理后，加入 50 µL 补充的 4 号裂解缓冲液（1X），在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。将 16 µL 裂解物转移至 384 孔低体积白色微孔板，加入 4 µL HTRF 磷酸化鼠源 STING 或总鼠源 STING 检测抗体。最后，在室温下孵育 2 小时后记录 HTRF 信号。ADU-S100 可显著激活 STING 通路，使 RAW264.7 细胞和 NIH3T3 细胞中 STING 的磷酸化水平分别提高 9 倍和 5 倍。诱导的 STING 磷酸化伴随其表达水平的下调，这与自噬介导的降解过程一致。
