DFA300-96S-1

使用 HTRF 总 BRD3 试剂盒评估 HAP1 细胞（野生型）和五种不同的 HAP1 敲除细胞系（分别敲除 BRD2、BRD4（BET 家族）、BRD7 或 BRD9（第四家族））中 BRD3 的表达水平。事先已对细胞密度进行优化，以确保 HTRF 检测处于试剂盒的动态范围内（数据未显示）。

将 6 种不同的细胞系在 96 孔板中（50,000 个细胞 / 孔）于 37°C、5% CO₂条件下培养 24 小时。移除培养基后，用 50µL 补充的 4 号裂解缓冲液（1X）裂解细胞，然后将 16µL 细胞裂解物转移至小体积白色微孔板中，再加入 4µL 预混合的检测试剂。室温过夜孵育后记录 HTRF 信号。

在 HAP1 BRD3 敲除细胞中，HTRF 信号与非特异性信号（虚线）相当，表明 BRD3 基因完全沉默；而正如预期，在其他细胞系中可很好地检测到 BRD3 水平。

注意：i）与野生型 HAP1 相比，在 BRD2、BRD4、BRD7 和 BRD9 敲除细胞系中未检测到 BRD3 水平的降低，这表明 HTRF BRD3 试剂盒相对于 BRD2、BRD4、BRD7 和 BRD9 具有选择性；ii）在 HAP1 BRD2 敲除和 HAP1 BRD4 敲除细胞中，BRD2 和 BRD4 的表达水平显著高于野生型 HAP1，这提示存在代偿机制。

使用敲除 HAP1 细胞系验证总 BRD3 检测的特异性

将 HeLa 细胞在 T175 培养瓶中的完全培养基中于 37°C、5% CO₂条件下培养。孵育 48 小时并移除细胞培养基后，用 3mL 补充的 4 号裂解缓冲液（1X）在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。

用补充的 4 号裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，将 16µL 各稀释液转移至小体积白色微孔板中，然后加入 4µL HTRF 总 BRD3 检测试剂。

使用等量的裂解物进行 HTRF 和蛋白质印迹法的平行比较。

在此条件下，HTRF 总 BRD3 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 2 倍。

HTRF 总 BRD3 检测与蛋白质印迹法的比较

BRD3 信号通路
BRD3 与超乙酰化染色质区域（也称为超级增强子区域）结合，在转录调控中发挥作用。它在染色质上提供一个支架，用于招募 E2F 蛋白等进行染色质重塑。当被 CREB 结合蛋白（CRB）乙酰化后，转录因子 GATA1 也会招募 BRD3，以激活和抑制靶基因并促进其染色质占据。

HTRF 总 BRD3 检测的信号通路

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DELFIA ANTI-MOUSE AB 96W KIT, 1 PLATE

使用敲除 HAP1 细胞系验证 HTRF 总 BRD3 检测的特异性

HTRF 总 BRD3 检测与蛋白质印迹法的比较

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