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LBS SW-SPECTAPLATE-384 /2X25C 低结合潜孔透明384孔板-50块

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上海普纳生物技术有限公司
将 16µL 裂解物转移至 384 孔低体积白色微孔板中，加入 4µL HTRF BRD4 检测抗体。过夜孵育后记录 HTRF 信号。


如预期（Raina 等人，《美国国家科学院院刊》，2019 年；Winter 等人，《分子细胞》，2017 年；Nowak 等人，《自然化学生物学》，2018 年），这三种 BRD4 PROTAC 降解剂触发 BRD4 蛋白呈剂量依赖性减少，其 DC50 * 在纳摩尔范围内，而在 ARV-471 对照条件下，BRD4 的表达水平保持稳定。


在相同条件下观察到管家基因 GAPDH 信号降低，表明高浓度 PROTAC 可能诱导细胞毒性。


DC50 指降解剂使 50% 的靶蛋白降解时的浓度。

使用 siRNA 验证 HTRF 总 BRD4 检测的特异性

将 MCF7 细胞以 25,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔板中，培养 24 小时。然后用针对 BRD1/2/3/4/7/9 和 BRDT 的特异性 siRNA 以及阴性对照 siRNA 转染细胞。孵育 24 小时后，裂解细胞，将 16µL 裂解物转移至 384 孔低体积白色微孔板中，然后加入 4µL HTRF 总 BRD4 检测抗体。过夜孵育后记录 HTRF 信号。


与阴性 siRNA 相比，BRD4 siRNA 使 BRD4 表达水平降低了 56%，而在其他 BRD siRNA 转染的细胞中，HTRF BRD4 信号保持稳定。值得注意的是，在相同条件下，管家基因 GAPDH 信号未发生变化。这些结果共同证明了 HTRF BRD4 检测的特异性和选择性。


使用 siRNA 验证总 BRD4 检测的特异性 ——BRD4


使用 siRNA 验证总 BRD4 检测的特异性 ——GAPDH

HTRF 总 BRD4 检测与蛋白质印迹法的比较

将 MCF7 细胞在 T175 培养瓶中的完全培养基中于 37°C、5% CO₂条件下培养。孵育 48 小时后，移除细胞培养基，用 3mL 补充的 4 号裂解缓冲液（1X）在室温下轻轻振荡 30 分钟裂解细胞。


使用补充的 4 号裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，将 16µL 每种稀释液转移至低体积白色微孔板中，然后加入 4µL HTRF 总 BRD4 检测试剂。


使用等量的裂解物进行 HTRF 与蛋白质印迹法的平行比较。


在这些实验条件下，HTRF 总 BRD4 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 8 倍。


HTRF 总 BRD4 检测与蛋白质印迹法的比较


简化通路

BRD4 信号通路
BRD4 与超乙酰化染色质区域（也称为超级增强子区域）结合，并招募多种转录共激活因子，促进形成一个大型的转录调节蛋白平台。该复合物进一步在超级增强子和启动子之间形成桥梁，NFKB 和其他转录因子（TF）在此结合。最后，P-TEFb 刺激 RNA 聚合酶 II，进而启动包括 c-Myc 或 K-Ras 等癌基因在内的多个基因的转录。


该示意图改编自 Muddassir 等人，《RSC Advances》，2021 年。


pathway-BRD4-total.svg（BRD4 总检测信号通路图）


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