HTRF BTK P-Y223 KIT - 50K PTS

概述

布鲁顿酪氨酸激酶（BTK）参与B细胞受体和NF-κB信号通路，在原发性免疫缺陷中发挥重要作用，尤其与X连锁无丙种球蛋白血症（XLA）相关。磷酸化BTK检测可用于检测布鲁顿酪氨酸激酶在酪氨酸223（Tyr223）位点的磷酸化情况。工作原理

磷酸化BTK（Tyr223）检测原理 磷酸化BTK（Tyr223）检测用于测量Tyr223位点磷酸化的BTK。与蛋白质印迹法不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。磷酸化BTK（Tyr223）检测使用两种标记抗体：一种带有供体荧光团，另一种带有受体荧光团。第一种抗体经筛选可特异性结合蛋白质上的磷酸化基序，第二种抗体则能不依赖磷酸化状态识别该蛋白质。蛋白质磷酸化会促使形成包含两种标记抗体的免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生FRET（荧光共振能量转移）信号。该信号强度与样品中磷酸化蛋白质的浓度直接成正比，且无需洗涤步骤即可评估蛋白质的磷酸化状态。 磷酸化BTK（Tyr223）双板检测方案 双板方案包括先在96孔板中培养细胞，裂解后将裂解物转移至384孔小体积检测板，再加入磷酸化BTK（Tyr223）HTRF检测试剂。此方案可监测细胞的活力和汇合度。 磷酸化BTK（Tyr223）单板检测方案 使用HTRF试剂检测磷酸化BTK（Tyr223）可在同一板中完成，该板可用于细胞培养、刺激和裂解。无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现小型化，同时保持稳定的HTRF检测质量。 检测验证 人K562细胞中磷酸化及总BTK的HTRF检测与蛋白质印迹法的比较 将人红白血病K562细胞在37°C、5% CO₂条件下培养2天。裂解并离心后，沉淀细胞重悬于无血清培养基中，用100µM过钒酸盐处理20分钟。然后裂解细胞，离心10分钟后收集可溶性上清液。对细胞裂解物进行系列稀释后检测表明，用于检测磷酸化BTK和总BTK的两种HTRF检测方法的灵敏度是蛋白质印迹法的16倍以上。 B细胞淋巴瘤细胞系Raji中总BTK和磷酸化BTK的积累 采用双板检测方案，将人B细胞淋巴瘤细胞系Raji细胞以200,000个细胞/孔的密度接种到半块96孔板中，每孔加入20µl无血清培养基。在37°C条件下，用10µL不同浓度的过钒酸盐处理20分钟（每组三个重复）后，加入10µL补充的1号裂解缓冲液（4倍浓度），在室温下轻轻振荡30分钟裂解细胞。将16µL裂解物转移至384孔小体积白色微孔板中，加入4µL预混合的检测抗体。过夜孵育后记录HTRF信号。 依鲁替尼（Ibrutinib）对BTK磷酸化的抑制作用 将人红白血病K562细胞和人B细胞淋巴瘤Raji细胞分别以100,000个细胞/孔和200,000个细胞/孔的密度接种到半块96孔板中，每孔加入20µl无血清培养基。在37°C条件下，用5µL不同浓度的依鲁替尼处理2小时后，加入5µL 50µM过钒酸盐，在37°C条件下处理20分钟。然后加入10µL补充的1号裂解缓冲液（4倍浓度），在室温下轻轻振荡30分钟裂解细胞。将16µL裂解物转移至384孔小体积白色微孔板中，加入4µL预混合的检测抗体。过夜孵育后记录HTRF信号。 P505-15对BTK磷酸化的抑制作用 将人红白血病K562细胞和人B细胞淋巴瘤Raji细胞分别以100,000个细胞/孔和200,000个细胞/孔的密度接种到半块96孔板中，每孔加入20µl无血清培养基。在37°C条件下，用5µL不同浓度的P505-15处理2小时后，加入5µL 50µM过钒酸盐，在37°C条件下处理20分钟。然后加入10µL补充的1号裂解缓冲液（4倍浓度），在室温下轻轻振荡30分钟裂解细胞。将16µL裂解物转移至384孔小体积白色微孔板中，加入4µL预混合的检测抗体。过夜孵育后记录HTRF信号。 简化通路 BTK简化通路 BTK是一种主要在B细胞中表达的胞质酪氨酸激酶。它参与多个信号转导通路，调控B系淋巴细胞的存活、活化、增殖和分化。B细胞受体（BCR）信号的启动涉及Src家族的Lyn和Syk。Lyn使BCR的胞内结构域磷酸化，进而招募并磷酸化Syk，最终导致SLP65磷酸化。这会招募BTK并使其在Tyr551位点磷酸化，随后BTK在Tyr223位点自磷酸化以实现完全激活。 pathway-btk.svg（BTK通路相关图示）规格参数

其他规格 应用领域：细胞信号传导 品牌：HTRF 检测方式：HTRF 分子修饰：磷酸化 产品类别：试剂盒 样品体积：16µL 运输条件：干冰运输 目标类别：磷酸化蛋白质 目标物种：人 技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET） 治疗领域：肿瘤学/炎症 单位规格：50,000个检测点