HTRF SMAD3 P-S423/425KIT - 50K PTS

概述

这种基于HTRF细胞的检测方法能够快速、定量地检测丝氨酸423/425（Ser423/425）位点磷酸化的SMAD3，以此作为转化生长因子-β（TGF-ß）信号活性的读数。TGF-ß受体通过在Ser423/425位点磷酸化直接激活SMAD3，使其转运至细胞核并调控涉及凋亡、迁移、分化以及免疫/炎症反应和细胞外基质重塑的基因表达。工作原理

磷酸化SMAD3（Ser423/425）检测原理 磷酸化SMAD3（Ser423/425）检测用于测量Ser423/425位点磷酸化的SMAD3。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。磷酸化SMAD3（Ser423/425）检测使用两种标记抗体：一种带有供体荧光团，另一种带有受体荧光团。第一种抗体经筛选可特异性结合蛋白质上的磷酸化基序，第二种抗体则能不依赖磷酸化状态识别该蛋白质。蛋白质磷酸化会促使形成包含两种标记抗体的免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生FRET（荧光共振能量转移）信号。该信号强度与样品中磷酸化蛋白质的浓度直接成正比，且无需洗涤步骤即可评估蛋白质的磷酸化状态。 磷酸化SMAD3（Ser423/425）双板检测方案 双板方案包括先在96孔板中培养细胞，裂解后将裂解物转移至384孔小体积检测板，再加入磷酸化SMAD3（Ser423/425）HTRF检测试剂。此方案可监测细胞的活力和汇合度。 磷酸化SMAD3（Ser423/425）单板检测方案 使用HTRF试剂检测磷酸化SMAD3（Ser423/425）可在同一板中完成，该板可用于细胞培养、刺激和裂解。无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现小型化，同时保持稳定的HTRF质量。 检测验证 磷酸化SMAD3检测的HTRF方法与蛋白质印迹法的比较 将细胞培养至80%汇合度，用TGF-ß1处理30分钟。裂解后，通过离心收集可溶性上清液。对裂解物进行系列稀释，转移至小体积白色微孔板中，最后加入HTRF磷酸化SMAD3检测试剂。使用等量的裂解物进行HTRF方法与蛋白质印迹法的对比。结果显示，HTRF磷酸化SMAD3检测的灵敏度是蛋白质印迹法的16倍。 在小鼠细胞系NIH/3T3和C2C12上的验证 将小鼠NIH/3T3和C2C12细胞系接种（100,000个细胞/孔），在完全培养基中于37°C、5% CO₂条件下培养2小时。次日，用不同浓度的TGF-ß1在37°C、5% CO₂条件下处理细胞30分钟。移除培养基后，加入50µL补充的4号裂解缓冲液，在室温下轻轻振荡30分钟裂解细胞，将16µL裂解物分两次转移至小体积白色微孔板中，然后加入4µL HTRF磷酸化SMAD3或总SMAD3检测抗体。过夜孵育后记录HTRF信号。在这两种细胞系中，TGF-ß1均通过Ser423/425位点的磷酸化促进SMAD3的激活，而该蛋白质的表达水平则保持相对稳定。 肝细胞和肝星状细胞（HSCs）中TGF-ß/SMAD信号的过度激活促进肝纤维化 将人LX-2*和HepG2细胞系接种（分别为50,000和200,000个细胞/孔），在完全培养基中于37°C、5% CO₂条件下过夜培养。然后用不同浓度的TGF-ß1在37°C、5% CO₂条件下处理细胞30分钟。移除培养基后，加入50µL补充的4号裂解缓冲液，在室温下轻轻振荡30分钟裂解细胞，将16µL裂解物分两次转移至小体积白色微孔板中，然后加入4µL HTRF磷酸化SMAD3或总SMAD3检测抗体。过夜孵育后记录HTRF信号。在这两种细胞系中，TGF-ß1处理均诱导SMAD3在Ser423/425位点的磷酸化，而该蛋白质的表达水平未受显著影响。 *LX-2细胞系由EMD Millipore提供（货号#SCC064） 简化通路 TGF-ß信号通路 TGF-ß信号通过TßRI和TßRII复合物介导，该复合物通过磷酸化激活细胞内的SMAD3。TGF-ß配体与TßRII结合后，会招募TßRI进入配体-受体复合物。TßRII发生自磷酸化，然后转磷酸化TßRI。激活的TßRI进而磷酸化SMAD3的Ser423和Ser425位点，使其能够与SMAD4形成寡聚体。该复合物随后转运至细胞核，与共激活因子和共抑制因子一起作为转录因子，调控多个涉及细胞生长、凋亡、增殖、迁移、分化以及细胞外基质重塑和免疫/炎症反应的基因表达。抑制性SMAD6和SMAD7参与该通路的反馈抑制。规格参数

其他规格 应用领域：细胞信号传导 品牌：HTRF 检测方式：HTRF 分子修饰：磷酸化 产品类别：试剂盒 样品体积：16µL 运输条件：干冰运输 目标类别：磷酸化蛋白质 目标物种：人、小鼠 技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET） 治疗领域：心血管疾病、代谢/糖尿病、非酒精性脂肪性肝炎/纤维化（NASH/Fibrosis）、肿瘤学/炎症 单位规格：50,000个检测点