HTRF CREB TOTAL KIT - 50K PTS

概述

这是一种均相细胞检测方法，用于监测磷酸化血管内皮生长因子受体2（VEGFR2，Tyr1175）的变化。VEGFR2介导的信号数据可用于血管生成、血管通透性和癌症干细胞调控研究。工作原理

磷酸化VEGFR2（Tyr1175）检测原理 磷酸化VEGFR2（Tyr1175）检测用于测量Tyr1175位点磷酸化的VEGFR2。与蛋白质印迹法不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。磷酸化VEGFR2（Tyr1175）检测使用两种标记抗体：一种带有供体荧光团，另一种带有受体荧光团。第一种抗体经筛选可特异性结合蛋白质上的磷酸化基序，第二种抗体则能不依赖磷酸化状态识别该蛋白质。蛋白质磷酸化会促使形成包含两种标记抗体的免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生FRET（荧光共振能量转移）信号。该信号强度与样品中磷酸化蛋白质的浓度直接成正比，且无需洗涤步骤即可评估蛋白质的磷酸化状态。 principle1.svg（原理1.svg） 磷酸化VEGFR2（Tyr1175）双板检测方案 双板方案包括先在96孔板中培养细胞，裂解后将裂解物转移至384孔小体积检测板，再加入磷酸化VEGFR2（Tyr1175）HTRF检测试剂。此方案可监测细胞的活力和汇合度。 protocol2.svg（方案2.svg） 磷酸化VEGFR2（Tyr1175）单板检测方案 使用HTRF试剂检测磷酸化VEGFR2可在同一板中完成，该板可用于细胞培养、刺激和裂解。无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现小型化，同时保持稳定的HTRF质量。 assay-protocol3.svg（检测方案3.svg） 检测验证 人血管内皮生长因子（VEGF）刺激人脐静脉内皮细胞（Huvec）导致VEGFR2蛋白酪氨酸1175残基磷酸化 将HUVEC细胞以不同的细胞密度接种到96孔板中。在37°C、5% CO₂条件下过夜孵育后，加入系列稀释的人VEGF，在37°C、5% CO₂条件下处理3分钟。移除刺激培养基，向细胞中加入50µL裂解缓冲液。轻轻振荡30分钟完成裂解。将16µL样品转移至384孔小体积板中，然后加入4µL磷酸化VEGFR2 HTRF检测试剂。过夜记录信号。检测窗口随细胞密度的增加而增大。 tyr1175-4.svg（tyr1175-4.svg） VEGF对磷酸化VEGFR2 Tyr1175细胞检测的刺激动力学 将HUVEC细胞以100,000个细胞/孔的密度接种到96孔板中。在37°C、5% CO₂条件下过夜孵育后，加入系列稀释的人VEGF，在37°C、5% CO₂条件下处理不同时间。移除刺激培养基，向细胞中加入50µL裂解缓冲液。轻轻振荡30分钟完成裂解。将16µL样品转移至384孔小体积板中，然后加入4µL磷酸化VEGFR2 HTRF检测试剂。过夜记录信号。较短的刺激时间更有利于获得最佳检测窗口。 phospho-tyr1175-5.svg（磷酸化-tyr1175-5.svg） 在Huvec细胞上使用磷酸化VEGFR2细胞检测的HTRF方法与蛋白质印迹法的比较 将人HUVEC细胞培养至80%汇合度。经人VEGF处理3分钟后，裂解细胞，离心收集可溶性上清液。对细胞裂解物进行系列稀释，将16µL各稀释液转移至384孔小体积白色微孔板中，最后加入VEGFR2细胞检测试剂盒试剂。对比结果显示，HTRF总量检测的灵敏度至少是蛋白质印迹法的32倍。 phospho-tyr1175-6.svg（磷酸化-tyr1175-6.svg） 简化通路 VEGFR2信号通路 血管内皮生长因子（VEGF）是一种内皮细胞特异性有丝分裂因子，常与肿瘤诱导的血管生成激活相关。在肿瘤中，VEGF的分泌上调。在 endothelial细胞表面，分泌的蛋白质以高亲和力结合至少两种不同的血管内皮生长因子受体（VEGFRs），即VEGFR-1（也称为fms样酪氨酸激酶，Flt-1）和VEGFR-2（也称为胎儿肝激酶，Flk-1）。VEGF激活内皮细胞会导致受体自磷酸化和后续的信号传导。已有多种磷酸化位点被报道。VEGFR与血管生成有关，联合抑制VEGF和血小板衍生生长因子（PDGF）信号可促进肿瘤血管消退。 pathway7.svg（通路7.svg）规格参数

其他规格 应用领域：细胞信号传导 品牌：HTRF 检测方式：HTRF 分子修饰：磷酸化 产品类别：试剂盒 样品体积：16µL 运输条件：干冰运输 目标类别：磷酸化蛋白质 目标物种：人 技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET） 治疗领域：心血管疾病、非酒精性脂肪性肝炎/纤维化（NASH/Fibrosis）、神经科学、肿瘤学/炎症 单位规格：50,000个检测点