HTRF BTK TOTAL KIT - 50K PTS

概述

总BTK细胞检测可监测总BTK水平，并且在我们的磷酸化BTK试剂盒中，可作为关于稳态水平的归一化检测。BTK参与B细胞受体和NF-κB信号通路，在原发性免疫缺陷中发挥重要作用，尤其与X连锁无丙种球蛋白血症（XLA）相关。工作原理

总BTK检测原理 总BTK检测用于定量细胞裂解物中BTK的表达水平。与蛋白质印迹法不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。总BTK检测使用两种标记抗体：一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。两种抗体均对该蛋白上的不同表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在BTK时，添加这些偶联物会使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生FRET信号。信号强度与样品中蛋白质的浓度直接成正比，并且可在无需洗涤的检测格式下评估蛋白质的表达。 总BTK双板检测方案 双板方案包括：先在96孔板中培养细胞，然后进行裂解，接着将裂解物转移至384孔低体积检测板，之后添加总BTK HTRF检测试剂。该方案能够监测细胞活力和汇合度。 总BTK单板检测方案 使用HTRF试剂检测总BTK可在单个培养板中完成，该培养板同时用于细胞培养、刺激和裂解。无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现微型化，同时保持稳定的HTRF检测质量。检测验证

使用人红白血病K562细胞的总BTK检测对HTRF检测与蛋白质印迹法进行比较 将人红白血病K562细胞接种到T175培养瓶的完全培养基中，在37°C、5% CO₂条件下孵育2天。离心后，将细胞沉淀重悬于无胎牛血清（FBS）的培养基中（6 mL培养基，含4×10⁶个细胞/mL），并用100 µM过钒酸盐在37°C下处理20分钟，随后用3 mL补充的裂解缓冲液#1在室温下轻轻振荡裂解30分钟。离心10分钟后收集可溶性上清液。将细胞裂解物在补充的裂解缓冲液中进行系列稀释，取16 µL各稀释液转移至384孔低体积白色微孔板中，然后添加4 µL总HTRF检测试剂。使用等量的裂解物进行蛋白质印迹法与HTRF检测的平行比较。 人B细胞淋巴瘤Raji细胞系中总BTK和磷酸化BTK（Tyr223）的积累 采用双板检测方案，将人B细胞淋巴瘤Raji细胞系以2×10⁵个细胞/孔的密度接种到半块96孔板中，每孔含20 µL无FBS培养基。在37°C下用10 µL不同浓度的过钒酸盐处理20分钟（每组设3个复孔）后，加入10 µL补充的裂解缓冲液#1（4倍浓度），在室温下轻轻振荡裂解30分钟。取16 µL裂解物转移至384孔低体积白色微孔板中，并加入4 µL预混合的检测抗体。孵育过夜后记录HTRF信号。 依鲁替尼对BTK磷酸化的抑制作用 将人红白血病K562细胞和人B细胞淋巴瘤Raji细胞分别以1×10⁵个细胞/孔和2×10⁵个细胞/孔的密度接种到半块96孔板中，每孔含20 µL无FBS培养基。在37°C下用5 µL不同浓度的依鲁替尼处理2小时后，加入5 µL 50 µM过钒酸盐，在37°C下处理20分钟。随后用10 µL补充的裂解缓冲液#1（4倍浓度）在室温下轻轻振荡裂解30分钟。取16 µL裂解物转移至384孔低体积白色微孔板中，并加入4 µL预混合的检测抗体。孵育过夜后记录HTRF信号。 Syk抑制剂P505-15对BTK磷酸化的抑制作用 将人红白血病K562细胞和人B细胞淋巴瘤Raji细胞分别以1×10⁵个细胞/孔和2×10⁵个细胞/孔的密度接种到半块96孔板中，每孔含20 µL无FBS培养基。在37°C下用5 µL不同浓度的P505-15处理2小时后，加入5 µL 50 µM过钒酸盐，在37°C下处理20分钟。随后用10 µL补充的裂解缓冲液#1（4倍浓度）在室温下轻轻振荡裂解30分钟。取16 µL裂解物转移至384孔低体积白色微孔板中，并加入4 µL预混合的检测抗体。孵育过夜后记录HTRF信号。 简化通路 BTK简化通路 BTK是一种主要在B细胞中表达的胞质酪氨酸激酶。它参与多种信号转导通路，调控B系淋巴细胞的存活、激活、增殖和分化。B细胞受体（BCR）信号的启动涉及Src家族的Lyn和Syk。Lyn使BCR的胞内结构域磷酸化，进而招募并磷酸化Syk，最终导致SLP65磷酸化。这会引发BTK在Tyr551位点的招募和磷酸化，随后BTK在Tyr223位点发生自磷酸化，从而实现完全激活。规格参数

其他规格 应用领域 细胞信号传导 品牌 HTRF 检测方式 HTRF 分子修饰 总（蛋白） 产品类别 试剂盒 样品体积 16 µL 运输条件 干冰运输 靶标类别 磷酸化蛋白 靶标物种 人 技术原理 时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET） 治疗领域 肿瘤学与炎症 单位规格 50,000个检测点