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HTRF VASP P-S239 KIT - 50K PTS

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概述

磷酸化 VASP（Ser239）细胞检测是监测 PKG 激活的理想方法，PKG 可使 VASP 的 239 位丝氨酸磷酸化。VASP 参与细胞运动、迁移和黏附过程，这使得磷酸化 VASP 检测成为心血管、肿瘤和炎症研究中的宝贵工具。

工作原理

磷酸化 VASP（Ser239）检测原理

磷酸化 VASP（Ser239）检测用于测量在 239 位丝氨酸发生磷酸化的 VASP。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。此检测使用两种标记抗体：一种带有供体荧光团，另一种带有受体荧光团。第一种抗体经筛选可特异性结合蛋白质上的磷酸化基序，第二种抗体则能识别蛋白质，且不受其磷酸化状态影响。蛋白质磷酸化会促使形成包含两种标记抗体的免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团接近，从而产生 FRET 信号。信号强度与样品中磷酸化蛋白质的浓度直接成正比，且该检测采用无需洗涤的格式，为评估蛋白质磷酸化状态提供了便利。

1phospho-how-it-works-total-btk-assay-principle.svg（磷酸化 VASP 检测原理示意图）

磷酸化 VASP（Ser239）双板检测方案

双板方案的流程为：先在 96 孔板中培养细胞，裂解后将裂解液转移至 384 孔小体积检测板，再加入磷酸化 VASP（Ser239）HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

磷酸化 VASP（Ser239）单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测磷酸化 VASP（Ser239）可在同一微孔板中完成，该板可用于细胞培养、刺激和裂解，无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现微型化，同时保持稳定的 HTRF 检测质量。

检测验证

HTRF 检测与蛋白质印迹法在小鼠 NIH3T3 细胞磷酸化 VASP（S239）检测中的对比

将小鼠 NIH3T3 细胞以 8×10⁶个细胞的密度接种于 T175 cm² 培养瓶中，在 37°C、5% CO₂条件下培养 48 小时。用 50μM 福司柯林处理 30 分钟后，加入 3mL 裂解缓冲液，在室温下轻轻振荡裂解 30 分钟。用补充的裂解缓冲液对细胞裂解液进行系列稀释，取 16μL 各稀释液转移至 384 孔小体积白色微孔板中，然后加入 4μL HTRF 磷酸化 VASP（Ser239）检测试剂。取等量裂解液同时进行蛋白质印迹法和 HTRF 检测以作对比。HTRF 检测仅需 2500 个细胞即可实现最小信号检测，而蛋白质印迹法则需要 40,000 个细胞才能检测到信号。因此，磷酸化 VASP（Ser239）HTRF 检测的灵敏度至少是蛋白质印迹法的 4 倍。

福司柯林处理的 A431 细胞验证

将人 A431 细胞以 100,000 个细胞 / 孔的密度接种于 96 孔板中，在 37°C、5% CO₂条件下培养 24 小时。用不同浓度的福司柯林处理 30 分钟后，移除培养基，加入 60μL 裂解缓冲液，在室温下轻轻振荡裂解 30 分钟。取 16μL 裂解液转移至 384 孔小体积白色微孔板中，然后加入 4μL HTRF 磷酸化 VASP（Ser157）、磷酸化 VASP（S239）或总 VASP 检测试剂。孵育过夜后记录 HTRF 信号。

福司柯林处理的 NIH3T3 细胞验证

将小鼠 NIH3T3 细胞以 100,000 个细胞 / 孔的密度接种于 96 孔板中，在 37°C、5% CO₂条件下培养 24 小时。用不同浓度的福司柯林处理 30 分钟后，移除培养基，加入 60μL 裂解缓冲液，在室温下轻轻振荡裂解 30 分钟。取 16μL 裂解液转移至 384 孔小体积白色微孔板中，然后加入 4μL HTRF 磷酸化 VASP（Ser157）、磷酸化 VASP（S239）或总 VASP 检测试剂。孵育过夜后记录 HTRF 信号。

简化通路

VASP 的功能与调控

血管扩张剂刺激磷蛋白（VASP）是一种肌动蛋白相关蛋白，属于 Ena-VASP 家族。VASP 可促进肌动蛋白丝延长，参与细胞骨架重塑和细胞极性调控，还涉及轴突导向、血小板活化和细胞迁移等过程。在血小板中，VASP 是环磷酸腺苷（cAMP）依赖性蛋白激酶 A（PKA）和环磷酸鸟苷（cGMP）依赖性蛋白激酶 G（PKG）的主要底物。PKA 的优选作用位点是 157 位丝氨酸（Ser-157），而 PKG 的优选作用位点是 239 位丝氨酸（Ser-239）。磷酸化可调节 VASP 与 F - 肌动蛋白的结合、肌动蛋白丝延长及血小板活化。在心血管疾病研究中，VASP 的磷酸化常被用于监测降低血小板反应性的药物效果。

规格参数

其他规格

应用领域：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
分子修饰：磷酸化
产品类别：试剂盒
样品体积：16μL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷蛋白
靶标物种：人、小鼠
技术原理：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域：心血管疾病、代谢 / 糖尿病
单位规格：50,000 个检测点

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货号：63ADK065PEY

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