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HTRF (H) CYCLIN E1 TOTAL KIT - 10K PTS HTRF人源总细胞周期蛋白 E1检测试剂盒，10,000测试

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品牌： Revvity

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概述

E 型周期蛋白在静止细胞向细胞周期转换过程中发挥重要作用。已知的 E 型周期蛋白有两种，即周期蛋白 E1（Cyclin E1）和周期蛋白 E2（Cyclin E2）。周期蛋白 E1 可激活细胞周期蛋白依赖性激酶 2（CDK2），诱导 S 期转换及与有丝分裂相关的 DNA 合成，其过表达与多种癌症直接相关。

该试剂盒与总 CDK2 和磷酸化 CDK2 试剂盒（货号 64CDK2TPEG 和 64CDK2Y15PEG）的缓冲液兼容，因此同一份裂解物可用于分析总周期蛋白 E1、总 CDK2 和酪氨酸 15 磷酸化 CDK2 的水平。

工作原理

总周期蛋白 E1 检测原理

总周期蛋白 E1 检测可对细胞裂解物中周期蛋白 E1 的表达水平进行定量。与蛋白质印迹法不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。检测使用两种标记抗体：一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团，且均对周期蛋白 E1 的特定表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在周期蛋白 E1 时，两种抗体结合形成复合物，使供体与受体荧光团靠近，产生 FRET 信号。信号强度与蛋白质浓度直接成正比，且可在免洗涤形式下评估表达水平。

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总周期蛋白 E1 双板检测方案

双板方案流程为：在 96 孔板中培养细胞，裂解后将裂解物转移至 384 孔小体积检测板，再加入总周期蛋白 E1 HTRF 检测试剂。该方案可监测细胞活力和汇合度。

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总周期蛋白 E1 单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测总周期蛋白 E1 可在单个培养、处理及裂解用板中完成，无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案支持微型化操作，同时保持稳定的 HTRF 检测质量。

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检测验证

使用羟基脲（Hydroxyurea）和阿非迪霉素（Aphidicolin）上调总周期蛋白 E1

将 HeLa 细胞接种于 96 孔板（100,000 个细胞 / 孔），培养 6 小时后，用不同浓度的羟基脲（单链断裂诱导剂）或阿非迪霉素（细胞周期阻滞剂）处理过夜。裂解细胞后，取 16 µL 裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板，加入 4 µL HTRF 总周期蛋白 E1 检测抗体，孵育 3 小时后记录 HTRF 信号。

结果符合预期：羟基脲或阿非迪霉素存在时，总周期蛋白 E1 水平升高。

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使用诺考达唑（Nocodazole）抑制总周期蛋白

将 HeLa 细胞以 100,000 个细胞 / 孔接种于含完全培养基的 96 孔板，37°C、5% CO₂条件下孵育 6 小时，再用不同浓度的诺考达唑处理 16 小时，随后用 50 µL 补充的 2 号裂解缓冲液（1X）在室温下轻摇裂解 30 分钟。检测时，取 16 µL 裂解物转移至小体积白色微孔板，加入 4 µL 总周期蛋白 E1 检测试剂，孵育 3 小时后记录 HTRF 信号。

诺考达唑（细胞周期阻滞剂）处理使细胞中周期蛋白 E1 含量呈剂量依赖性降低。ATPlite™检测显示 ATP 水平稳定，表明该处理对细胞增殖或活力无影响。

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通过 siRNA 实验验证 HTRF 人总周期蛋白 E1 检测的特异性

将 HeLa 细胞接种于 96 孔板（50,000 个细胞 / 孔），培养 24 小时后，用针对周期蛋白 E1、E2 的特异性 siRNA 及阴性对照 siRNA 转染细胞。48 小时后裂解细胞，取 16 µL 裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板，加入 4 µL HTRF 总周期蛋白 E1 检测抗体，孵育 3 小时后记录 HTRF 信号。

转染周期蛋白 E1 siRNA 的细胞信号较阴性对照降低 80%，而转染周期蛋白 E2 siRNA 的细胞信号无降低，表明该检测对周期蛋白 E1 具有特异性，不与 E2 交叉反应。

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HTRF 人总周期蛋白 E1 检测在人细胞系中的通用性

将贴壁人细胞系 HeLa、MCF7、U20S 或 HAP1 以 100,000 个细胞 / 孔接种于 96 孔板，24 小时后用补充的裂解缓冲液裂解，取 16 µL 裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板，加入 4 µL HTRF 总周期蛋白 E1 检测试剂，孵育 3 小时后记录 HTRF 信号。

该检测可有效检测多种表达不同水平周期蛋白 E1 的细胞模型。

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HTRF 总周期蛋白 E1 检测与蛋白质印迹法（WB）的比较

将 U2OS 细胞在 T175 培养瓶中培养 48 小时，移除培养基后用 3 mL 补充的 2 号裂解缓冲液（1X）室温轻摇裂解 30 分钟。对裂解物进行系列稀释，取 16 µL 转移至小体积白色微孔板，加入 4 µL HTRF 总周期蛋白 E1 检测试剂，同时用等量裂解物进行 WB 检测。

该条件下，HTRF 检测的灵敏度是 WB 的 16 倍。

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简化通路

周期蛋白 E1 信号通路

周期蛋白通过定时表达及结合、激活细胞周期蛋白依赖性激酶（CDKs），调控细胞分裂周期有序进行。周期蛋白 E1 和 E2 激活 CDK2：G1 期时，有丝分裂原刺激的 CDK4/6 与 D 型周期蛋白结合，促进周期蛋白 E 转录及 CDK2/E 激酶活性激活；S 期时，周期蛋白 E 因自身磷酸化等事件被泛素化并经蛋白酶体降解，水平下降。

周期蛋白 E1 直接参与 DNA 复制起始、组蛋白生物合成调控及中心体周期，与多种恶性肿瘤进展相关，临床常提示不良预后。

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规格

其他规格

应用：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
兼容的裂解缓冲液：1 号、2 号、3 号、4 号裂解缓冲液
分子修饰：总量
产品类别：试剂盒
样品体积：16 µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷蛋白
靶标物种：人
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
单位规格：10,000 个检测点

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货号：64CYCE1TPEH

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