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HTRF YAP TOTAL KIT - 500 PTS

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概述

基于细胞的总 YAP 检测旨在监测 YAP 蛋白（包括磷酸化和非磷酸化形式）的表达水平。它使用与我们的磷酸化 YAP 试剂盒相同的缓冲液，能够从单个样本中分析磷酸化蛋白和总蛋白，从而更好地解读 Hippo-YAP 通路。YAP 作为 Hippo 通路中的核心介导因子，是肿瘤疾病研究的重要靶标。

工作原理

总 YAP 检测原理

总 YAP 检测用于定量细胞裂解物中 YAP 的表达水平。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。总 YAP 检测使用两种标记抗体：一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。两种抗体都对 YAP 蛋白上的特定表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在 YAP 时，添加这些偶联物会使供体荧光团与受体荧光团接近，从而产生 FRET（荧光共振能量转移）信号。信号强度与样本中 YAP 蛋白的浓度直接成正比，且该检测采用无需洗涤的格式即可评估蛋白表达。

总 YAP 双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，裂解后将裂解物转移至 384 孔小体积检测板，再添加总 YAP HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞活力和汇合度。

总 YAP 单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测总 YAP 可在单个培养板中完成，该板可用于细胞培养、刺激和裂解，无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案支持实验微型化，同时保持稳定的 HTRF 检测质量。

检测验证

HTRF 总 YAP 检测与多种细胞系的兼容性

将人类细胞（HEK293、HEK293 A、U-2 OS、HeLa、乳腺癌细胞、MCF 10A）和小鼠细胞（NIH 3T3）以 100,000 个细胞 / 孔的密度接种在 96 孔板中，使用无血清细胞培养基培养，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时。随后移除培养基，加入 50 µL 裂解缓冲液，在室温下轻轻振荡裂解 30 分钟。取 16 µL 裂解物转移至 384 孔白色小体积微孔板中，加入 4 µL HTRF 总 YAP Ser127 检测试剂，孵育过夜后记录 HTRF 信号。

HTRF 检测与基于总 YAP 细胞检测的蛋白质印迹法（WB）对比

人类乳腺癌细胞在 T175 培养瓶中于 37°C、5% CO₂条件下培养 48 小时。移除培养基后，加入 3 mL 补充的裂解缓冲液，在室温下裂解 30 分钟。离心 10 分钟后收集可溶性组分，用补充的裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，然后取 16 µL 各稀释液，分别通过蛋白质印迹法和 HTRF 检测进行平行分析。结果显示，HTRF 总 YAP 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 2 倍：使用 HTRF 检测，仅需 2,000 个细胞即可产生可检测的最小信号；而蛋白质印迹法则需要 4,000 个细胞才能产生信号。

血清刺激对总 YAP 的动力学影响

将 100,000 个 HEK293A 细胞接种在 96 孔板中，使用无血清细胞培养基在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时。然后加入血清，在不同时间点进行处理。移除细胞培养基后，加入 50 µL 裂解缓冲液，在室温下轻轻振荡裂解 30 分钟。取 16 µL 裂解物转移至 384 孔白色小体积微孔板中，加入 4 µL HTRF 总 YAP 检测试剂，孵育过夜后记录 HTRF 信号。结果表明，血清处理过夜可获得最佳的总 YAP 蛋白量。

简化通路

Hippo-YAP 细胞信号传导（激活通路）

Hippo/YAP 通路通过调控细胞增殖与凋亡的平衡来调节器官大小，还参与机械信号和细胞骨架信号的转导。该通路可被多种刺激激活，如细胞黏附、高细胞密度、机械张力或缺乏生长因子等。通路激活后，首先激活 MTS 激酶，进而磷酸化 Lats 激酶。随后，YAP 在丝氨酸 127 位被磷酸化，导致其滞留于细胞质中，最终被蛋白酶体降解。因此，磷酸化的 YAP 代表该蛋白的失活形式。已有研究报道，YAP/TAZ 突变存在于某些癌症类型中（如乳腺癌、肺癌、卵巢癌和结肠癌）。

Hippo-YAP 细胞信号传导（失活通路）

Hippo/YAP 通路通过调控细胞增殖与凋亡的平衡来调节器官大小，此外还参与机械信号和细胞骨架信号的转导。当 Hippo/YAP 通路失活时，YAP/TAZ 在细胞核内积累，并诱导细胞增殖相关基因的转录。除了其自身特性和致癌潜力外，Hippo/Yap 通路中的某些突变会导致过度生长表型，这在器官大小上可体现出来。最终，Hippo/yap 通路的失调会赋予癌细胞自我再生的特性（Cordenonsi 等人，《细胞》，2011 年；Pan D 等人，《基因与发育》，2007 年；Pan D 等人，《发育细胞》，2010 年）。

规格参数

其他规格
应用领域：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
裂解缓冲液兼容性：
- 裂解缓冲液 1
- 裂解缓冲液 4
- 裂解缓冲液 5
分子修饰：总蛋白
产品类别：试剂盒
样本体积：16 µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷酸化蛋白
靶标物种：
- 人类
- 小鼠
技术：TR-FRET（时间分辨荧光共振能量转移）
治疗领域：非酒精性脂肪性肝炎 / 纤维化（NASH/Fibrosis）
单位规格：500 次检测

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货号：64YATPEG

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