登录 • 注册 购物车 13310039714

当前位置：首页 > 产品中心 > Revvity 均相检测试剂 > Phosphoproteins > HTRF (H) ATM P-S1981 KIT - 500 PTS 人磷酸化共济失调毛细血管扩张突变激酶（丝氨酸1981）检测试剂盒，500测试

  • HTRF (H) ATM P-S1981 KIT - 500 PTS 人磷酸化共济失调毛细血管扩张突变激酶（丝氨酸1981）检测试剂盒，500测试
/

HTRF (H) ATM P-S1981 KIT - 500 PTS 人磷酸化共济失调毛细血管扩张突变激酶（丝氨酸1981）检测试剂盒，500测试

分享给好友
下载产品资料
rvty_ls_manual_64atms1peg-64atms1peh
下载SDS
rvty_ls_sds_64ATMS1PEG_US rvty_ls_sds_64ATMS1PEG_UK rvty_ls_sds_64ATMS1PEG_SPA rvty_ls_sds_64ATMS1PEG_ITA rvty_ls_sds_64ATMS1PEG_ELL rvty_ls_sds_64ATMS1PEG_DEU rvty_ls_sds_64ATMS1PEG_FRA
收藏 咨询

品牌： Revvity

  • 产品详情
  • 相关解决方案
  • 相关资源
  • 相关视频
  • 相关问答

概述


这种基于 HTRF 细胞的检测方法能够快速、定量地检测丝氨酸 1981（Ser1981）位点磷酸化的 ATM，以此作为 DNA 损伤应答（DDR）时 ATM/CHK2 信号通路的读出指标。该试剂盒与磷酸化 CHK2 苏氨酸 68（Thr68）检测试剂盒相辅相成，可用于 ATM-CHK2 通路的研究。


当细胞受到 DNA 损伤（如双链断裂（DSBs））时，ATM-Chk2 通路和复制检查点应答会被激活。这些通路会介导 G1/S 期检查点，使细胞周期进程停滞，为 DNA 修复争取额外时间。


在应对 DNA 双链断裂时，ATM 会发生自身磷酸化，形成有活性的单体激酶。ATM 的激活会导致多种下游靶标磷酸化，例如 H2A 组蛋白家族成员 X（H2Ax）、检查点激酶 Chk2 及其下游效应分子。


工作原理

HTRF 磷酸化 ATM 检测原理

磷酸化 ATM（Ser1981）检测用于测量在 Ser1981 位点发生磷酸化的 ATM。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。


磷酸化 ATM（Ser1981）检测使用两种标记抗体：一种标记有供体荧光团，另一种标记有受体荧光团。第一种抗体经筛选可特异性结合蛋白质上的磷酸化基序，第二种抗体则能不依赖蛋白质的磷酸化状态识别该蛋白质。蛋白质磷酸化会促使两种标记抗体形成免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生 FRET 信号。信号强度与样品中磷酸化蛋白质的浓度直接成正比，且该检测采用免洗涤格式，为评估蛋白质的磷酸化状态提供了便利。


phospho-how-it-works-phospho-btk-tyr223-a1.svg

HTRF 磷酸化 ATM Ser1981 双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，然后裂解细胞，再将裂解物转移至 384 孔低体积检测板，最后加入磷酸化 ATM Ser1981 HTRF 检测试剂。


该方案能够监测细胞的活力和汇合度。


HTRF 总 BRD2 检测的双板方案

HTRF 磷酸化 ATM Ser1981 单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测磷酸化 ATM Ser1981 可在单个培养板中完成，该培养板同时用于细胞培养、刺激和裂解，无需洗涤步骤。


这种为高通量筛选（HTS）设计的方案可实现小型化操作，同时保持稳定的 HTRF 检测质量。


HTRF 总 BRD2 检测的单板方案


检测验证

新制癌菌素对总 ATM 和磷酸化 Ser1981 ATM 检测的影响

将人 HEK293 细胞接种到 96 孔培养处理板中（每孔 100,000 个细胞），加入完全培养基，在 37°C、5% CO₂条件下孵育过夜。随后，用不同浓度的新制癌菌素处理细胞 2 小时（37°C、5% CO₂）。之后，加入 50µl 补充的 1X 裂解缓冲液 #1，在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。细胞裂解后，取 16µL 裂解物转移至 384 孔低体积白色微孔板中，再加入 4µL HTRF 磷酸化 ATM（Ser1981）或总 ATM 检测试剂。室温孵育过夜后记录 HTRF 信号。


如预期所示，新制癌菌素会诱导单链和双链 DNA 损伤，导致 ATM 磷酸化呈剂量依赖性增加，而对总 ATM 蛋白的表达水平无影响。


1assay-validation-atm-total-1.svg

诱导 DNA 损伤的化合物对 ATM 磷酸化（Ser1981）和总蛋白的影响

将人 HEK293 细胞接种到 96 孔培养处理板中（每孔 100,000 个细胞），加入完全培养基，在 37°C、5% CO₂条件下孵育过夜。用不同浓度的新制癌菌素、羟基脲、阿霉素和依托泊苷处理细胞 2 小时（37°C、5% CO₂）。之后移除培养基，加入 50µl 补充的 1X 裂解缓冲液 #1，在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。细胞裂解后，取 16µL 裂解物转移至 384 孔低体积白色微孔板中，再加入 4µL HTRF 磷酸化 ATM（Ser1981）或总 ATM 检测试剂。室温孵育过夜后记录 HTRF 信号。


不同化合物呈现出不同的应答效果。已知新制癌菌素、阿霉素和依托泊苷会诱导双链断裂，在此实验中导致 ATM 磷酸化；而羟基脲主要诱导单链断裂，仅引起部分 ATM 磷酸化，且效力较弱。新制癌菌素、阿霉素、依托泊苷和羟基脲的半数有效浓度（EC50）分别为 0.2µM、1.4µM、0.9µM 和 0.3mM。


此外，新制癌菌素的 80% 有效浓度（EC80）经评估为 1µM，该浓度用于评估 ATM/CHK2 通路抑制剂。


这 4 种化合物均未影响总 ATM 蛋白的表达水平。


2assay-validation-atm-total-2.svg

ATR/CHK1 或 ATM/CHK2 通路抑制剂对 HTRF 磷酸化 Ser1981 和总 ATM 试剂盒的影响

将人 HEK293 细胞接种到 96 孔培养处理板中（每孔 100,000 个细胞），加入完全培养基，在 37°C、5% CO₂条件下孵育过夜。用不同浓度的 3 种 ATR 或 ATM 通路抑制剂处理细胞 2 小时（37°C、5% CO₂），随后用 1µM 新制癌菌素（EC80）继续处理 2 小时（37°C、5% CO₂）。移除培养基后，加入 50µl 补充的 1X 裂解缓冲液 #1，在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。细胞裂解后，取 16µL 裂解物转移至 384 孔低体积白色微孔板中，再加入 4µL HTRF 磷酸化 ATM Ser1981 或总 ATM 检测试剂。室温孵育过夜后记录 HTRF 信号。


已知咖啡因是一种温和的 ATR/ATM 通路抑制剂，UCN-1 是强效的 CHK1 抑制剂，KU55933 是选择性 ATM 通路抑制剂。如预期所示，UCN-1 对 ATM 磷酸化无影响；咖啡因会降低 ATM 磷酸化，但效力较弱；KU55933 能完全抑制 ATM 磷酸化，且效力更强。


这 3 种化合物均未影响总 ATM 蛋白的表达水平。


简化通路

ATM/CHK2 和 ATR/CHK1 信号通路

DNA 双链断裂（DSBs）或单链断裂（SSBs）是威胁基因组完整性的最有害损伤之一。它们可由细胞代谢物或 DNA 损伤剂（如遗传毒性化合物、化疗药物、紫外线（UV）照射或电离辐射）诱导产生。


DNA 损伤应答（DDR）主要由共济失调毛细血管扩张症突变蛋白（ATM）和共济失调毛细血管扩张症及 Rad3 相关蛋白（ATR）控制，二者均属于磷酸肌醇 3 - 激酶（PI3K）相关激酶（PIKK）家族。


当细胞受到 DNA 损伤（DSBs）时，ATM-Chk2 通路和复制检查点应答被激活，介导 G1/S 期检查点以停滞细胞周期进程，为 DNA 修复争取时间。


在应对 DNA 双链断裂时，ATM 发生自身磷酸化，形成有活性的单体激酶。ATM 的激活会导致多种下游靶标磷酸化，例如 H2A 组蛋白家族成员 X（H2Ax）、检查点激酶 Chk2 及其下游效应分子。


新的 ATM 小分子抑制剂的发现，以及新的检查点调控策略的设计和验证，与传统的放疗和化疗相结合，有望改善癌症的治疗效果。


规格


其他规格
应用：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
裂解缓冲液兼容性：裂解缓冲液 1、裂解缓冲液 4
分子修饰：磷酸化
产品类别：试剂盒
样品体积：16 µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷酸化蛋白
靶标物种：人类
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
单位规格：500 个检测点


    没有数据
    没有数据
    没有数据
货号：64ATMS1PEG
一键复制
参考价格 ¥ 29723.99
产品规格
  • 1盒/500测试 ￥29723.99
参考货期：3-4周
选择数量
当前规格1件起购
加入购物车 询价
相关靶点蛋白推荐
上海普纳生物技术有限公司
将 16µL 裂解物转移至 384 孔低体积白色微孔板中，加入 4µL HTRF BRD4 检测抗体。过夜孵育后记录 HTRF 信号。


如预期（Raina 等人，《美国国家科学院院刊》，2019 年；Winter 等人，《分子细胞》，2017 年；Nowak 等人，《自然化学生物学》，2018 年），这三种 BRD4 PROTAC 降解剂触发 BRD4 蛋白呈剂量依赖性减少，其 DC50 * 在纳摩尔范围内，而在 ARV-471 对照条件下，BRD4 的表达水平保持稳定。


在相同条件下观察到管家基因 GAPDH 信号降低，表明高浓度 PROTAC 可能诱导细胞毒性。


DC50 指降解剂使 50% 的靶蛋白降解时的浓度。

使用 siRNA 验证 HTRF 总 BRD4 检测的特异性

将 MCF7 细胞以 25,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔板中，培养 24 小时。然后用针对 BRD1/2/3/4/7/9 和 BRDT 的特异性 siRNA 以及阴性对照 siRNA 转染细胞。孵育 24 小时后，裂解细胞，将 16µL 裂解物转移至 384 孔低体积白色微孔板中，然后加入 4µL HTRF 总 BRD4 检测抗体。过夜孵育后记录 HTRF 信号。


与阴性 siRNA 相比，BRD4 siRNA 使 BRD4 表达水平降低了 56%，而在其他 BRD siRNA 转染的细胞中，HTRF BRD4 信号保持稳定。值得注意的是，在相同条件下，管家基因 GAPDH 信号未发生变化。这些结果共同证明了 HTRF BRD4 检测的特异性和选择性。


使用 siRNA 验证总 BRD4 检测的特异性 ——BRD4


使用 siRNA 验证总 BRD4 检测的特异性 ——GAPDH

HTRF 总 BRD4 检测与蛋白质印迹法的比较

将 MCF7 细胞在 T175 培养瓶中的完全培养基中于 37°C、5% CO₂条件下培养。孵育 48 小时后，移除细胞培养基，用 3mL 补充的 4 号裂解缓冲液（1X）在室温下轻轻振荡 30 分钟裂解细胞。


使用补充的 4 号裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，将 16µL 每种稀释液转移至低体积白色微孔板中，然后加入 4µL HTRF 总 BRD4 检测试剂。


使用等量的裂解物进行 HTRF 与蛋白质印迹法的平行比较。


在这些实验条件下，HTRF 总 BRD4 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 8 倍。


HTRF 总 BRD4 检测与蛋白质印迹法的比较


简化通路

BRD4 信号通路
BRD4 与超乙酰化染色质区域（也称为超级增强子区域）结合，并招募多种转录共激活因子，促进形成一个大型的转录调节蛋白平台。该复合物进一步在超级增强子和启动子之间形成桥梁，NFKB 和其他转录因子（TF）在此结合。最后，P-TEFb 刺激 RNA 聚合酶 II，进而启动包括 c-Myc 或 K-Ras 等癌基因在内的多个基因的转录。


该示意图改编自 Muddassir 等人，《RSC Advances》，2021 年。


pathway-BRD4-total.svg（BRD4 总检测信号通路图）


规格



    没有数据
    没有数据
    没有数据
货号：64BRD4TPEH
一键复制
参考价格 ¥ 172916.60
产品规格
  • 请咨询 ￥172916.60
参考货期：3-4周
选择数量
当前规格1件起购
加入购物车 询价
相关靶点蛋白推荐