HTRF (H) AUR A TOTAL KIT - 50K PTS

概述

这种基于HTRF细胞的检测方法能够方便且准确地检测在真核生物中广泛表达的人源Aurora A蛋白（与AURKA基因相关）。Aurora A属于丝氨酸/苏氨酸Aurora激酶家族（包括Aurora B和Aurora C），通过调节有丝分裂，特别是染色体分离过程，在细胞分裂中发挥关键作用。它主要通过苏氨酸288残基的自磷酸化被激活，这一过程主要发生在细胞分裂周期的S期晚期到M期，或在DNA损伤应答过程中。Aurora激酶在多种癌症（白血病、结肠癌、前列腺癌和乳腺癌）中存在过表达，这使其成为开发Aurora激酶抑制剂（AKIs）的热门靶点。工作原理

总Aurora A检测原理 总Aurora A检测用于定量细胞裂解物中Aurora A的表达水平。与蛋白质印迹法不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。总Aurora A检测使用两种标记抗体：一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。两种抗体都对该蛋白上的不同表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在Aurora A时，加入这些偶联物会使供体荧光团与受体荧光团接近，从而产生FRET信号。其强度与样品中蛋白质的浓度直接成正比，并且在无需洗涤的检测形式下即可评估蛋白质的表达。 总Aurora A双板检测方案 双板方案包括先在96孔板中培养细胞，然后裂解细胞，再将裂解物转移到384孔小体积检测板中，之后加入总Aurora A HTRF检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。 HTRF总BRD2检测的双板方案 总Aurora A单板检测方案 使用HTRF试剂检测总Aurora A可在单个用于培养、刺激和裂解的板中进行。无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现微型化，同时保持稳定的HTRF质量。 HTRF总BRD2检测的单板方案 检测验证 在HeLa细胞中检测总Aurora A和磷酸化Aurora A（Thr288）的激活情况 HeLa细胞（永生化人宫颈癌上皮细胞系）以100,000个细胞/孔的密度接种在96孔培养处理板中，在完全培养基中培养24小时以使其贴壁。移除细胞培养基后，在37°C、5% CO₂条件下，用不同浓度的诺考达唑处理细胞20小时。过夜处理（20小时）后，移除细胞培养基，向每个孔中加入50μL补充的1X裂解缓冲液#1，在室温下轻轻振荡30分钟。细胞裂解后，将16μL裂解物转移到384孔小体积白色微孔板中，并加入4μL HTRF总Aurora A或磷酸化Aurora A（Thr288）检测抗体。过夜孵育后记录HTRF信号。 诺考达唑是一种微管去稳定剂，可诱导G2/M细胞周期停滞。有研究表明，经诺考达唑处理的细胞会表现出更高的Aurora蛋白表达水平，以克服细胞周期停滞[1]。 正如预期的那样，所得结果显示，经诺考达唑处理后，总Aurora A蛋白和苏氨酸288磷酸化的Aurora A蛋白水平均有所增加。 [1]：Jiang等人，《癌基因》，2003年 在HeLa细胞上使用磷酸化Aurora A（Thr288）和总Aurora A进行抑制剂表征

经阿利塞替布处理的HeLa细胞中的总Aurora A和磷酸化Aurora A HeLa细胞（永生化人宫颈癌上皮细胞系）以100,000个细胞/孔的密度接种在96孔培养处理板中，在完全培养基中培养24小时以使其贴壁。移除细胞培养基后，在含有5%胎牛血清的细胞培养基中，用不同浓度的抑制剂（MLN8054、托沙替尼或阿利塞替布）与200nM的诺考达唑共同孵育处理细胞20小时，培养条件为37°C、5% CO₂。过夜处理后，移除细胞培养基，向每个孔中加入50μL补充的1X裂解缓冲液#1，在室温下轻轻振荡30分钟。细胞裂解后，将16μL裂解物转移到384孔小体积白色微孔板中，并加入4μL HTRF总Aurora A或磷酸化Aurora A（Thr288）检测抗体。过夜孵育后记录HTRF信号。 文献中已证实这3种化合物对磷酸化Aurora A（苏氨酸288）具有抑制作用，最大抑制率可达98%，且不影响总蛋白水平[2,3,4,5]。 正如预期的那样，结果显示，经MLN8054、托沙替尼或阿利塞替布处理后，苏氨酸288位点的Aurora A磷酸化受到明显的剂量依赖性抑制，而Aurora A蛋白的表达水平保持不变。 [2]：Manfredi等人，《美国国家科学院院刊》，2006年 [3]：Sells等人，《ACS药物化学快报》，2015年 [4]：Tyler等人，《细胞周期》，2007年 [5]：Qi等人，《白血病研究》，2013年 使用基因沉默（SiRNA）验证HTRF总Aurora A检测的特异性和选择性 在96孔板中（25,000个细胞/孔），用25nM的SMARTPool ON - TARGETplus siRNA（Horizon）处理HeLa细胞，这些siRNA分别特异性靶向Aurora A（#L - 003545 - 01 - 0005）、Aurora B（#L - 003326 - 00 - 0005）和Aurora C（#L - 019573 - 00 - 0005），或使用非靶向siRNA（#D - 001810 - 10 - 20，作为对照），在100μL体系中处理24小时。移除细胞培养基后，在完全细胞培养基中加入300nM诺考达唑刺激细胞，在37°C、5% CO₂条件下再孵育24小时。移除培养基后，用50μL 1X裂解缓冲液#1在室温下轻轻振荡30分钟裂解细胞，将16μL裂解物转移到小体积白色微孔板中，然后加入4μL预混合的HTRF总Aurora A检测抗体。在室温下过夜孵育后记录HTRF信号。 与转染非靶向siRNA的细胞相比，用Aurora A siRNA处理的细胞中Aurora A显著下调，信号降低44%。 尽管这3种家族蛋白之间具有高度同源性，但用Aurora B或Aurora C siRNA处理的细胞未观察到信号降低，这证明了该试剂盒的特异性和选择性。 在多种人源细胞系上的验证 将永生化人源细胞系HepG2（肝癌）、HeLa（宫颈癌）、HEK293和HCT116（结肠癌）以25,000或100,000个细胞/孔的密度接种在96孔培养板中，在37°C、5% CO₂条件下孵育24小时。移除细胞培养基后，在完全细胞培养基中加入300nM诺考达唑刺激细胞，在37°C、5% CO₂条件下处理20小时。移除培养基后，用50μL补充的1X裂解缓冲液裂解细胞，在室温下轻轻振荡30分钟。 使用HTRF总Aurora A试剂盒评估Aurora A蛋白的表达水平。简要步骤为：将16μL细胞裂解物转移到小体积白色微孔板中，然后加入4μL预混合的HTRF检测试剂。在室温下过夜孵育后记录HTRF信号。 在所有测试的人源细胞系中都能很好地检测到Aurora A蛋白，且表达水平不同。对于特定的细胞模型，必须优化细胞密度，使其处于试剂盒的动态范围内。值得注意的是，HepG2细胞表达较高水平的Aurora A蛋白，与HeLa、HEK293或HCT116（25,000至100,000个细胞/孔）相比，其使用的细胞密度必须更低（25,000个细胞/孔或更低）才能处于动态范围内。 HTRF总Aurora A检测能够有效检测表达不同水平Aurora A蛋白的多种人源细胞模型中的内源性Aurora A蛋白。 HTRF总Aurora A检测与蛋白质印迹法的比较 在T175培养瓶中，于完全培养基中37°C、5% CO₂条件下培养HeLa细胞。孵育24小时后，先用300nM诺考达唑在37°C、5% CO₂条件下刺激细胞20小时，然后用3mL补充的1X裂解缓冲液#1在室温下轻轻振荡30分钟裂解细胞。 使用补充的裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，将16μL每种稀释液转移到小体积白色微孔板中，然后加入4μL HTRF总Aurora A检测试剂。使用等量的裂解物进行HTRF和蛋白质印迹法的平行比较。 蛋白质印迹法与HTRF的平行比较表明，至少在这些实验条件下，HTRF检测的灵敏度是蛋白质印迹法的4倍。 简化通路 简化的Aurora A信号通路 Aurora激酶是一个丝氨酸/苏氨酸激酶家族，包括Aurora A（AURKA）、Aurora B（AURKB）和Aurora C（AURKC），它们通过调节有丝分裂，特别是染色体分离过程，在细胞分裂中是必不可少的激酶。 Aurora A的激活是通过其激活环上苏氨酸288残基的自磷酸化实现的，主要发生在细胞分裂周期的S期晚期到M期，或在DNA损伤应答过程中。这一激活需要多种辅助因子，包括微管相关蛋白TPX2和INCENP。Aurora A可磷酸化多个靶标，例如PLK1（与辅助因子Bora结合）以激活PLK1级联反应，从而控制有丝分裂和纺锤体组装的关键方面，或激活应对DNA损伤的恢复通路。Aurora A通过蛋白磷酸酶1（PP1）对苏氨酸288的去磷酸化而失活。Aurora激酶在多种癌症（白血病、结肠癌、前列腺癌和乳腺癌）中存在过表达，这使其成为开发Aurora激酶抑制剂（AKIs）的热门靶点。规格

其他规格 应用 细胞信号传导 品牌 HTRF 检测方式 HTRF 裂解缓冲液兼容性 裂解缓冲液1 裂解缓冲液4 分子修饰 总蛋白 产品类别 试剂盒 样品体积 16μL 运输条件 干冰运输 靶标类别 磷蛋白 靶标物种 人 技术 时间分辨荧光共振能量转移（TR - FRET） 单位规格 500个检测点