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HTRF SYK P-Y525/526 KIT - 50K PTS

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概述

这种基于 HTRF 细胞的检测方法可便捷、准确地检测 Tyr525/526 位点磷酸化的 SYK 蛋白。

SYK（脾酪氨酸激酶）是一种胞质酪氨酸 / 丝氨酸激酶，在信号转导中发挥关键作用，尤其在免疫细胞中，如 B 细胞、巨噬细胞、小胶质细胞（脑内驻留巨噬细胞）、中性粒细胞和肥大细胞。细胞受到刺激后，SYK 与活化免疫受体的胞质结构域相互作用，并结合到特定的磷酸化受体基序（称为 “p-ITAMs”）上，通过其催化结构域在 Tyr525/526 位点的自身磷酸化而被激活。

抗 IgM 刺激的 Ramos B 细胞中 SYK 的激活

将人 B 细胞淋巴瘤 Ramos 细胞系以 100,000 个细胞 / 孔的密度接种到半块 96 孔培养处理板中，每孔加入 20 µL 无胎牛血清（FBS）的培养基。在 37°C、5% CO₂条件下过夜孵育后，用 10 µL 不同浓度的抗人 IgM 抗体刺激细胞 10 分钟，然后用 10 µL 补充的 3 号裂解缓冲液（4X）在室温下轻轻振荡 30 分钟裂解细胞。检测步骤中，将 16 µL 细胞裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，并加入 4 µL HTRF 磷酸化 SYK（Tyr525/526）或总 SYK 检测试剂。孵育过夜后记录 HTRF 信号。

抗人 IgM 抗体诱导 Tyr525/526 位点的 SYK 磷酸化呈剂量依赖性增加，而该蛋白的表达水平未发生变化，表明细胞表面的 B 细胞受体（BCR）复合物被激活。

Assay validation syk phospho tyr（SYK 磷酸化 Tyr 检测验证）

经 P505-15 处理的巨噬细胞分化的 THP-1 细胞中 SYK 的抑制

将人单核细胞 THP-1 细胞系以 200,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔培养处理板中，在 37°C、5% CO₂条件下用 100 ng/mL 佛波酯（PMA）孵育 24 小时，使其分化为巨噬细胞。分化后，先用不同剂量的 SYK 抑制剂 P505-15 处理细胞 1 小时，然后用 250 µM 过钒酸盐处理 10 分钟。处理后，用 50 µL 补充的 3 号裂解缓冲液（1X）在室温下轻轻振荡 30 分钟裂解细胞，将 16 µL 细胞裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，再加入 4 µL HTRF 磷酸化 SYK（Tyr525/526）或总 SYK 检测试剂。孵育过夜后记录 HTRF 信号。

正如预期的那样，SYK 抑制剂 P505-15 诱导 Tyr525/526 位点的 SYK 磷酸化呈剂量依赖性降低，而该激酶的表达水平不受该处理的影响。

HTRF 磷酸化 SYK（Tyr525/526）检测与蛋白质印迹法的比较

将人 B 细胞淋巴瘤 Ramos 细胞系在 T175 培养瓶中的完全培养基中，于 37°C、5% CO₂条件下培养 48 小时。离心后，沉淀的细胞用 20 µg/mL 的抗人 IgM 抗体刺激 10 分钟。再次离心后，用 10 mL 补充的 3 号裂解缓冲液（1X）在室温下轻轻振荡 30 分钟裂解细胞。

用补充的裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，将 16 µL 每种稀释液转移至小体积白色微孔板中，然后加入 4 µL HTRF 磷酸化 SYK（Tyr525/526）检测试剂。使用等量的裂解物进行 HTRF 与蛋白质印迹法的平行比较。

使用 HTRF 磷酸化 SYK（Tyr525/526）检测时，每孔 1,000 个细胞就足以检测到显著信号，而使用蛋白质印迹法需要 4,000 个细胞才能获得最小的化学发光信号。因此，在这些条件下，HTRF 磷酸化 SYK 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 4 倍。

简化通路

SYK 信号传导的简化通路

SYK（脾酪氨酸激酶）是一种胞质酪氨酸 / 丝氨酸激酶，在信号转导中发挥关键作用，尤其在免疫细胞中，如 B 细胞和小胶质细胞（脑内驻留巨噬细胞）。

当 B 细胞或 TREM2/DAP12 受体复合物受到刺激时，SYK 分别与 CD79 亚基或 DAP12 的胞质结构域相互作用，结合它们特定的磷酸化受体基序（称为 “p-ITAMs”）。这导致 SYK 通过其催化结构域在 Tyr525/526 位点的自身磷酸化而被激活。反过来，SYK 磷酸化下游底物（如 BTK），触发多种信号通路的激活和细胞反应，包括细胞活化、增殖和存活。

规格参数

其他规格参数

应用领域：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
分子修饰：磷酸化
产品类别：试剂盒
样品体积：16 µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷酸化蛋白
靶标物种：人类
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域：神经科学、肿瘤学与炎症
单位规格：50,000 个检测点

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货号：64SYKY525PEY

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