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HTRF (H) AUR B TOTAL KIT - 50K PTS

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概述

这种基于 HTRF 细胞的检测方法可便捷、准确地检测在真核生物中广泛表达的人源 Aurora B 蛋白（与 AURKB 基因相关）。Aurora B 属于丝氨酸 / 苏氨酸 Aurora 激酶家族（包括 Aurora A 和 Aurora C），通过调控有丝分裂（尤其是染色体分离过程）对细胞分裂至关重要。它通过苏氨酸 232 残基的自磷酸化被激活，这一过程主要发生在细胞分裂周期的晚 S 期到 M 期，或 DNA 损伤应答过程中。Aurora 激酶在多种癌症（白血病、结肠癌、前列腺癌和乳腺癌）中存在过表达，这使其成为开发 Aurora 激酶抑制剂（AKIs）的热门候选靶点。

工作原理

总 Aurora B 检测原理

总 Aurora B 检测可定量细胞裂解物中 Aurora B 的表达水平。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。总 Aurora B 检测使用两种标记抗体：一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。两种抗体都对该蛋白上的特定表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在 Aurora B 时，加入这些偶联物会使供体荧光团与受体荧光团接近，从而产生 FRET 信号。信号强度与样品中蛋白质的浓度直接成正比，且无需洗涤步骤即可评估蛋白质的表达水平。

总 Aurora B 双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，然后裂解细胞，再将裂解物转移到 384 孔小体积检测板中，最后加入总 Aurora B HTRF 检测试剂。该方案可监测细胞活力和汇合度。

HTRF 总 BRD2 检测的双板方案

总 Aurora B 单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测总 Aurora B 可在单个板中完成，该板可用于细胞培养、刺激和裂解，无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案可实现微型化，同时保持稳定的 HTRF 检测质量。

HTRF 总 BRD2 检测的单板方案

检测验证

在 HeLa 细胞中检测总 Aurora B 和磷酸化 Aurora B（Thr232）的激活

将 HeLa 细胞（永生化人宫颈癌细胞系）以 100,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔培养处理板中，在完全培养基中培养 24 小时以使其贴壁。移除细胞培养基后，用不同浓度的诺考达唑（Nocodazole）在 37°C、5% CO₂条件下处理 20 小时。过夜处理（20 小时）后，移除细胞培养基，向每个孔中加入 50 µL 补充的 1X 裂解缓冲液 #1，在室温下轻轻振荡 30 分钟。细胞裂解后，将 16 µL 裂解物转移到 384 孔小体积白色微孔板中，并加入 4 µL HTRF 总 Aurora B 或磷酸化 Aurora B（Thr232）检测抗体。过夜孵育后记录 HTRF 信号。

诺考达唑是一种微管去稳定剂，可诱导 G2/M 期细胞周期阻滞。已有研究表明，经诺考达唑处理的细胞会表现出更高的 Aurora 蛋白表达水平，以克服细胞周期阻滞。

正如预期，结果显示经诺考达唑处理后，总 Aurora B 蛋白和苏氨酸 232 磷酸化的 Aurora B 蛋白水平均有所增加。

利用 HeLa 细胞对磷酸化 Aurora B（Thr232）和总 Aurora B 进行抑制剂表征

将 HeLa 细胞（永生化人宫颈癌细胞系）以 100,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔培养处理板中，在完全培养基中培养 24 小时以使其贴壁。移除细胞培养基后，用不同浓度的抑制剂（托沙替尼或阿利塞替尼）与 200 nM 固定浓度的诺考达唑共同孵育，在 37°C、5% CO₂条件下，于含 5% 胎牛血清（SVF）的细胞培养基中处理 20 小时。过夜处理后，移除细胞培养基，向每个孔中加入 50 µL 补充的 1X 裂解缓冲液 #1，在室温下轻轻振荡 30 分钟。细胞裂解后，将 16 µL 裂解物转移到 384 孔小体积白色微孔板中，并加入 4 µL HTRF 总 Aurora B 或磷酸化 Aurora B（Thr232）检测抗体。过夜孵育后记录 HTRF 信号。

文献已证实，这两种化合物对磷酸化 Aurora B（苏氨酸 232）具有抑制作用，最大抑制率可达 96%，且不影响总蛋白水平 [2,3,4]。

正如预期，结果显示经托沙替尼或阿利塞替尼处理后，苏氨酸 232 位点的 Aurora B 磷酸化水平呈明显的剂量依赖性抑制，而 Aurora B 蛋白的表达水平保持不变。

[2]：Sells 等人，《ACS 药物化学快报》，2015 年
[3]：Tyler 等人，《细胞周期》，2007 年
[4]：Qi 等人，《白血病研究》，2013 年

利用基因沉默（SiRNA）验证 HTRF 总 Aurora B 检测的特异性和选择性

在 96 孔板中（25,000 个细胞 / 孔），用 25 nM 的 SMARTPool ON-TARGETplus siRNA（Horizon 公司）处理 HeLa 细胞，其中 siRNA 分别特异性靶向 Aurora A（#L-003545-01-0005）、Aurora B（#L-003326-00-0005）和 Aurora C（#L-019573-00-0005），或使用非靶向 siRNA（#D-001810-10-20，作为对照），在 100 µL 体系中处理 24 小时。移除细胞培养基后，在完全细胞培养基中加入 300 nM 诺考达唑刺激细胞，在 37°C、5% CO₂条件下额外孵育 24 小时。移除培养基后，用 50 µL 1X 裂解缓冲液 #1 裂解细胞，在室温下轻轻振荡 30 分钟，然后将 16 µL 裂解物转移到小体积白色微孔板中，再加入 4 µL 预混合的 HTRF 总 Aurora B 检测抗体。室温过夜孵育后记录 HTRF 信号。

用 Aurora B siRNA 处理细胞后，Aurora B 显著下调，与转染非靶向 siRNA 的细胞相比，信号降低了 58%。

尽管这三种家族蛋白之间具有高度同源性，但用 Aurora A 或 Aurora C siRNA 处理的细胞未观察到信号降低，这证明了该试剂盒的特异性。

在多种人源细胞系中的验证

将永生化人细胞系 HepG2（肝癌）、HeLa（宫颈癌）、HEK293 和 HCT116（结肠癌）以 25,000 或 100,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔培养板中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时。移除细胞培养基后，在完全细胞培养基中加入 300 nM 诺考达唑刺激细胞，在 37°C、5% CO₂条件下处理 20 小时。移除培养基后，用 50 µL 补充的 1X 裂解缓冲液 #1 裂解细胞，在室温下轻轻振荡 30 分钟。

使用 HTRF 总 Aurora B 试剂盒评估 Aurora B 蛋白的表达水平。简要步骤为：将 16 µL 细胞裂解物转移到小体积白色微孔板中，然后加入 4 µL 预混合的 HTRF 检测试剂。室温过夜孵育后记录 HTRF 信号。注意，必须优化细胞密度，使其处于试剂盒的动态范围内。

HTRF 总 Aurora B 检测可有效检测多种人源细胞模型中内源性 Aurora B 蛋白的表达，这些细胞模型中该蛋白的表达水平各不相同。

HTRF 总 Aurora B 检测与蛋白质印迹法的比较

在 T175 培养瓶中，于完全培养基中 37°C、5% CO₂条件下培养 HeLa 细胞。孵育 24 小时后，先用 300 nM 诺考达唑在 37°C、5% CO₂条件下刺激细胞 20 小时，然后用 3 mL 补充的 1X 裂解缓冲液 #1 在室温下轻轻振荡 30 分钟裂解细胞。

用补充的裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，将 16 µL 各稀释液转移到小体积白色微孔板中，然后加入 4 µL HTRF 总 Aurora B 检测试剂。使用等量的裂解物进行 HTRF 和蛋白质印迹法的平行比较。

蛋白质印迹法与 HTRF 的平行比较表明，至少在这些实验条件下，HTRF 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 4 倍。

规格参数

其他规格	详情
应用	细胞信号传导
品牌	HTRF
检测方式	HTRF
裂解缓冲液兼容性	裂解缓冲液 1 裂解缓冲液 4
分子修饰	总蛋白
产品类别	试剂盒
样品体积	16 µL
运输条件	干冰运输
靶标类别	磷酸化蛋白
靶标物种	人
技术	时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
单位规格	500 次检测

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货号：64AURBTPEY

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