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HTRF P70S6K P-T389 KIT - 10K PTS 磷酸化pS70S6K检测试剂 -10,000测试

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概述

本 HTRF（均相时间分辨荧光）细胞检测方法可便捷、精准地定量苏氨酸 389（Thr389）位点磷酸化的 p70S6K 蛋白。该试剂盒兼容大多数细胞类型，是筛选和研究对细胞增殖、存活、侵袭、运动性及胰岛素受体信号通路具有生物学影响的化合物的理想工具，其应用领域涵盖肿瘤学、代谢领域（糖尿病、肥胖症、衰老）、心血管疾病及神经退行性疾病。

工作原理

p70S6K（Thr389 位点磷酸化）检测原理

p70S6K（Thr389 位点磷酸化）检测针对 Thr389 位点发生磷酸化的 p70S6K 蛋白进行定量。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测为全板基检测，无需使用凝胶、进行电泳或转膜操作。

该检测采用两种标记抗体：一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。第一种抗体经筛选，可特异性结合蛋白质上的磷酸化基序（即 Thr389 磷酸化位点相关序列）；第二种抗体则能不依赖 p70S6K 的磷酸化状态对其进行识别。当 p70S6K 发生磷酸化时，会形成由两种标记抗体共同参与的免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团近距离接触，从而产生荧光共振能量转移（FRET）信号。该信号强度与样本中磷酸化 p70S6K 蛋白的浓度直接成正比，为 “免洗涤” 检测模式下评估 p70S6K 磷酸化状态提供了有效手段。

（图示标注：phospho-p70s6k-thr389-assay-principle，即 “p70S6K（Thr389 位点磷酸化）检测原理”）

p70S6K（Thr389 位点磷酸化）检测方案

1. 双板检测方案

双板检测方案的流程为：先在 96 孔板中培养细胞，随后进行细胞裂解，再将裂解液转移至 384 孔小体积检测板，最后加入 p70S6K（Thr389 位点磷酸化）HTRF 检测试剂。该方案可实现对细胞活力及汇合度的监测。

（图示标注：phospho-p70s6k-thr389-2-plate-assay-protocol，即 “p70S6K（Thr389 位点磷酸化）双板检测方案”）

2. 单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测 Thr389 位点磷酸化的 p70S6K 蛋白，可在单个培养板中完成 —— 该培养板同时用于细胞培养、刺激及裂解，无需洗涤步骤。此专为高通量筛选（HTS）设计的方案，能在实现实验微型化的同时，保持稳定可靠的 HTRF 检测质量。

（图示标注：phospho-p70s6k-thr389-1-plate-assay-protocol，即 “p70S6K（Thr389 位点磷酸化）单板检测方案”）

检测验证

p70S6K（Thr389 位点磷酸化）细胞检测：HTRF 法与蛋白质印迹法（WB）的对比

将人 HEK293 细胞（人胚肾细胞系）接种于 T175 培养瓶中，在 37°C、5% 二氧化碳（CO₂）条件下培养 1 天。第 2 天，移除细胞培养基后，加入 3 毫升补充型裂解缓冲液，孵育 30 分钟；离心 10 分钟后收集可溶性上清液。取等量裂解液，通过 HTRF 法与蛋白质印迹法进行平行对比检测。

结果显示：HTRF 法检测 p70S6K（Thr389 位点磷酸化）仅需 3000 个细胞，而蛋白质印迹法需 6000 个细胞；HTRF 磷酸化检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 2 倍。

（图示标注：assay-validation-p70s6k-phospho-t389-1，即 “p70S6K（Thr389 位点磷酸化）检测验证 1”）

药理学响应：激动剂与拮抗剂作用模式

将人 HEK293 细胞以每孔 10 万个细胞的密度接种，先用两种浓度的抑制剂（渥曼青霉素 Wortmannin、LY294002）孵育，再用 1.0 微摩尔（µM）胰岛素在 37°C 条件下刺激 30 分钟。细胞裂解孵育 30 分钟后，采用双板检测方案测定磷酸化 p70S6K 的水平，以验证抑制剂对胰岛素诱导的 p70S6K 磷酸化的拮抗作用。

（图示标注：assay-validation-p70s6k-phospho-t389-2，即 “p70S6K（Thr389 位点磷酸化）检测验证 2”）

雷帕霉素（Rapamycin）对刺激后 NIH3T3 细胞的抑制作用

将小鼠 NIH3T3 细胞（小鼠胚胎成纤维细胞系）以每孔 10 万 / 5 万 / 2.5 万个细胞的密度接种，先用不同浓度的雷帕霉素抑制剂孵育 3 小时，再用 1.0 微摩尔胰岛素在 37°C 条件下刺激 30 分钟。细胞裂解孵育 30 分钟后，采用双板检测方案和 p70S6K（Thr389 位点磷酸化）HTRF 检测，测定雷帕霉素对 p70S6K 磷酸化的抑制效果。

（图示标注：assay-validation-p70s6k-phospho-t389-3，即 “p70S6K（Thr389 位点磷酸化）检测验证 3”）

简化通路

p70S6K（Thr389 位点磷酸化）相关简化通路

p70S6K（核糖体 S6 激酶）是一种促存活因子，属于丝氨酸 / 苏氨酸蛋白激酶家族，其作用机制及功能如下：

信号定位：p70S6K 位于哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）的下游，是 mTOR 信号通路的关键效应分子；
核心功能：通过向 S6RP（核糖体 S6 蛋白）、elF4B（真核翻译起始因子 4B）、eEF2K（真核延伸因子 2 激酶）等重要下游效应分子传递信号，诱导蛋白质合成，进而调控细胞生长、增殖、存活与迁移；
其他作用：在胰岛素受体信号通路中，通过调控胰岛素底物（IRS1）参与信号传导；同时可通过抑制促凋亡蛋白 Bad 的活性，发挥抗凋亡的存活效应。

（图示标注：phospho-pathway-p70s6k-thr389-64s6kpeg，即 “p70S6K（Thr389 位点磷酸化）相关简化通路”）

规格参数

其他规格参数

应用领域：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF（均相时间分辨荧光）
裂解缓冲液兼容性：1 号裂解缓冲液、3 号裂解缓冲液
分子修饰类型：磷酸化
产品类别：试剂盒
样本体积：16 微升（µL）
运输条件：干冰运输（保障试剂活性稳定）
靶点类别：磷酸化蛋白
靶点物种：人、小鼠
技术平台：TR-FRET（时间分辨荧光共振能量转移，降低背景干扰）
治疗领域：代谢 / 糖尿病、神经科学（对应 p70S6K 相关疾病研究方向）
单位规格：10,000 个检测点（可完成 10,000 次独立检测反应）

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货号：64S6KPEH

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