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HTRF (H) BRD2 TOTAL KIT - 10K PTS

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概述

BRD2 属于溴结构域（BRD）家族 II（BET 家族）。与其他 BRD 家族蛋白一样，它能与乙酰化赖氨酸结合，充当组蛋白等蛋白质赖氨酸乙酰化状态的 “阅读器”。作为一种转录调节因子，它通过 E2F-RB 通路参与众多细胞过程（胚胎发生、周期调控、发育）。由于 BRD2 可调控 c-MYC、Bcl-2 等多种癌基因的转录，其失调与多种癌症密切相关。

因此，抑制 BRD2 功能已成为癌症治疗策略的一部分。最近，通过 PROTAC 分子靶向包括 BRD2 在内的 BET 家族蛋白降解，已成为一种新颖且前景广阔的治疗方法。

工作原理

总 BRD2 检测原理

HTRF 总 BRD2 检测用于定量细胞裂解物中 BRD2 的表达水平。与蛋白质印迹法不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。总 BRD2 检测采用两种标记抗体：一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。两种抗体均对该蛋白上的特定表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在 BRD2 时，加入这些偶联物会使供体荧光团与受体荧光团靠近，进而产生 FRET 信号。信号强度与样品中该蛋白的浓度直接成正比，且无需洗涤步骤即可评估蛋白的表达水平。

HTRF 总 BRD2 检测原理

总 BRD2 双板检测方案

双板方案的流程为：先在 96 孔板中培养细胞，裂解后将裂解物转移至 384 孔低体积检测板，再加入总 BRD2 HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

HTRF 总 BRD2 检测双板方案

总 BRD2 单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测总 BRD2 可在同一微孔板中完成，该板可用于细胞培养、刺激和裂解，无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案支持实验微型化，同时保持稳定的 HTRF 检测质量。

HTRF 总 BRD2 检测单板方案

检测验证

在多种人细胞系上的验证

将贴壁人细胞系 HEK293（胚胎肾）、HeLa（宫颈）、HAP1（慢性髓系白血病来源的近单倍体）和 MCF7（乳腺）以 50,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔培养板中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时。移除培养基后，用 50µL 补充的 4 号裂解缓冲液（1X）裂解细胞。

使用 HTRF 总 BRD2 试剂盒评估 BRD2 的表达水平。简要步骤为：将 16µL 细胞裂解物转移至低体积白色微孔板中，随后加入 4µL 预混合的 HTRF 检测试剂。室温过夜孵育后记录 HTRF 信号。虚线对应非特异性 HTRF 信号。需注意的是，预先对细胞密度进行了优化，以确保 HTRF 检测处于试剂盒的动态范围内（数据未显示）。

HTRF 总 BRD2 检测能有效检测多种表达不同水平该蛋白的细胞模型中的 BRD2。

总 BRD2 检测在多种细胞系上的验证

PROTAC® 诱导的 BRD2 降解

总 BRD2 检测的药理学验证 ——HeLa 细胞上的 PROTAC

总 BRD2 检测的药理学验证 ——HeLa 细胞上的 GAPDH

将 HeLa 细胞以 50,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔板中，在 37°C、5% CO₂条件下培养 24 小时。移除细胞培养基后，用一系列浓度递增的 PROTAC 化合物处理细胞：i）BET 家族中对 BRD2 特异性的 PROTACs——dBET6、ARV-7714 和 MZ-1；ii）ZHX-3-26，一种对 BRD4 有选择性但对 BRD2 无特异性的 PROTAC；iii）一种靶向雌激素受体 α 的无关阴性对照 ——ARV-471。过夜孵育后，移除细胞培养基，向每个孔中加入 50µL 补充的 4 号裂解缓冲液（1X）。细胞裂解后，将 16µL 裂解物转移至 384 孔低体积白色微孔板中，再加入 4µL HTRF BRD2 检测抗体。过夜孵育后记录 HTRF 信号。

BET 家族特异性 PROTAC 降解剂可引发 BRD2 蛋白呈剂量依赖性减少，而非特异性 PROTACs 则无此效果。此外，如 GAPDH 表达水平所示，PROTAC 化合物可能诱导细胞毒性机制。

DC50 指降解剂使 50% 的靶蛋白发生降解时的浓度。

使用敲除 HAP1 细胞系验证 HTRF 总 BRD2 检测的特异性

使用 HTRF 总 BRD2 试剂盒评估 HAP1 细胞（野生型）以及五种不同的 HAP1 敲除细胞系（分别敲除 BRD3、BRD4（BET 家族）、BRD7 或 BRD9（家族 IV））中 BRD2 的表达水平。预先对细胞密度进行了优化，以确保 HTRF 检测处于试剂盒的动态范围内（数据未显示）。

将这 6 种不同的细胞系以 50,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔板中，在 37°C、5% CO₂条件下培养 24 小时。移除培养基后，用 50µL 补充的 4 号裂解缓冲液（1X）裂解细胞，随后将 16µL 细胞裂解物转移至低体积白色微孔板中，并加入 4µL 预混合的检测试剂。室温过夜孵育后记录 HTRF 信号。

在 HAP1 BRD2 敲除细胞中，HTRF 信号与非特异性信号（虚线）相当，表明 BRD2 基因被完全沉默，而正如预期，在其他细胞系中能很好地检测到 BRD2 水平。

值得注意的是，在野生型以及 BRD3、BRD4、BRD7 和 BRD9 敲除细胞系中，检测到的 BRD2 蛋白表达水平相近，这表明我们的 HTRF BRD2 试剂盒对其他 BRD 蛋白具有选择性。

使用敲除 HAP1 细胞系验证总 BRD2 检测的特异性

HTRF 总 BRD2 检测与蛋白质印迹法的比较

将 HeLa 细胞在 T175 培养瓶中的完全培养基中于 37°C、5% CO₂条件下培养。孵育 48 小时后，移除细胞培养基，用 3mL 补充的 4 号裂解缓冲液（1X）在室温下轻轻振荡 30 分钟以裂解细胞。

使用补充的 4 号裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，将 16µL 每种稀释液转移至低体积白色微孔板中，然后加入 4µL HTRF 总 BRD2 检测试剂。

使用等量的裂解物对 HTRF 检测与蛋白质印迹法进行平行比较。

在这些实验条件下，HTRF 总 BRD2 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 16 倍。

HTRF 总 BRD2 检测与蛋白质印迹法的比较

简化通路

BRD2 信号通路
BRD2 与超乙酰化染色质区域（也称为超级增强子区域）结合。它在染色质上提供一个支架，用于招募 E2F 蛋白、HDACs、HAT 等蛋白质进行染色质重塑。BRD2 通过 E2F-RB 通路发挥作用，而 HDAC 可与 RB 结合以阻止转录过程。BRD2 与 SWI/SNF 复合物结合，参与组蛋白调控和基因转录。它招募由 CDK9 和细胞周期蛋白 T 组成的 pTEFb，以促进 RNA 聚合酶 II 的转录延伸。BRD2 是 STAT5 活性和 MYC 癌基因的关键介质。

HTRF 总 BRD2 检测信号通路

规格

应用：细胞信号传导
兼容自动化：是
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
兼容的裂解缓冲液：1 号裂解缓冲液、2 号裂解缓冲液、3 号裂解缓冲液、4 号裂解缓冲液
分子修饰：总量
产品类别：试剂盒
样品体积：16µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷蛋白
靶标物种：人
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域：肿瘤学与炎症
单位规格：10,000 个检测点

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货号：64BRD2TPEH

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