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HTRF (H/M) BRD7 TOTAL KIT - 10K PTS

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概述

总 BRD7 细胞检测可监测 BRD7 蛋白水平。

含溴结构域蛋白 7（BRD7），也称为 NAG4、BP75 或 CELTIX1，是溴结构域含蛋白家族 IV 的成员，该家族还包括 BRD9 蛋白。BRD7 主要定位于细胞核内，可调节染色质重塑。BRD7 是大型多溴 BAF（PBAF）复合体的组成部分，该复合体包含 ARID2、PBRM1 和 BAF45d，能与转录调节因子相互作用以调节基因表达。

更重要的是，近期研究表明，在某些癌症中，如上皮性卵巢癌、乳腺癌、鼻咽癌和结直肠癌，BRD7 的表达下调。与具有促癌作用的 BRD9 不同，BRD7 可能通过抑制磷脂酰肌醇 3 激酶（PI3K）通路发挥抑癌作用，该通路参与多种失调的致癌过程，如细胞凋亡、蛋白质合成、增殖和血管生成。

由于 BRD7 和 BRD9 蛋白有 72% 的氨基酸残基相似性，化合物很可能同时靶向抑癌基因 BRD7 和原癌基因 BRD9。因此，必须仔细研究靶向 BRD9 或 BRD7 的化合物的选择性。为此，HTRF 总 BRD7 检测试剂盒是 HTRF 总 BRD9 检测试剂盒的重要配套检测工具，可实现可靠的化合物分析。

工作原理

总 BRD7 检测原理

HTRF 总 BRD7 检测可定量细胞裂解物中 BRD7 的表达水平。与蛋白质印迹法不同，该检测完全基于微孔板，无需凝胶、电泳或转膜步骤。总 BRD7 检测使用两种标记抗体：一种与供体荧光团偶联，另一种与受体荧光团偶联。两种抗体都对该蛋白上的特定表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在 BRD7 时，添加这些偶联物会使供体荧光团与受体荧光团接近，从而产生 FRET 信号。其强度与样品中蛋白质的浓度直接成正比，并为在无需洗涤的检测格式下评估蛋白质表达提供了一种方法。

总 BRD7 双板检测方案

双板方案包括先在 96 孔板中培养细胞，然后裂解细胞，再将裂解物转移到 384 孔小体积检测板中，之后添加总 BRD7 HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

总 BRD7 单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测总 BRD7 可在单个用于培养、刺激和裂解的板中进行。无需洗涤步骤。这种高通量筛选设计的方案能够实现微型化，同时保持稳定的 HTRF 质量。

检测验证

在不同永生化的人源和鼠源肿瘤细胞模型上的验证

将贴壁的人源免疫细胞系 MCF7（乳腺）、HELA（宫颈）、SH-SY5Y（骨髓神经母细胞瘤）、HEK293（胚胎肾）以及鼠源细胞系 NIH3T3 和 Neuro2A 接种到 96 孔培养板中，密度为 50,000 个细胞 / 孔，并在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时。去除培养基后，用 50µL 补充的 4 号裂解缓冲液（1X）裂解细胞。

使用 HTRF 总 BRD7 试剂盒评估 BRD7 的表达水平。简要步骤为：将 16µL 细胞裂解物转移到小体积白色微孔板中，然后加入 4µL 预混合的 HTRF 检测试剂。在室温下孵育过夜后记录 HTRF 信号。虚线对应非特异性 HTRF 信号。请注意，细胞密度先前已优化，以确保在试剂盒的动态范围内进行 HTRF 检测（数据未显示）。

HTRF 总 BRD7 检测能有效检测各种表达不同水平该蛋白的细胞模型中的 BRD7。

PROTAC® 诱导的 BRD7 降解

MCF7 和 HeLa 细胞在 96 孔板中（50,000 个细胞 / 孔）于 37°C、5% CO₂条件下培养 24 小时。去除细胞培养基后，用不同浓度的 PROTAC 化合物 dBRD9 和 VZ185 以及作为阴性无关对照的 PROTAC ARV-471（PROTAC 雌激素受体）处理细胞。孵育过夜后，去除细胞培养基，并向每个孔中加入 50µL 补充的 4 号裂解缓冲液（1X）。细胞裂解后，将 16µL 裂解物转移到 384 孔小体积白色微孔板中，并加入 4µL HTRF BRD7 检测抗体。孵育过夜后记录 HTRF 信号。

在这两种细胞类型中，只有 VZ185 降解剂触发了 BRD7 蛋白的剂量依赖性减少，而在 BRD9 选择性 PROTAC（dBRD9）和 ARV-471 对照条件下，BRD7 的表达水平未受影响。请注意，与经 ARV-471 处理的 MCF7 细胞不同，HeLa 细胞中的 GAPDH 保持稳定。

这些结果表明 VZ185 PROTAC 可诱导 BRD7 降解，其 DC50 在纳摩尔范围内，如 Zoppi 等人（《药物化学杂志》，2019 年）所报道。

DC50 是指降解剂使 50% 的靶蛋白降解时的浓度。

BRD9 与 BRD7 的 PROTAC® 谱分析

由于 BRD9 是一种癌基因，而 BRD7 发挥抑癌作用，因此选择性降解 BRD9 而非 BRD7 具有重要意义。

HeLa 细胞在 96 孔板中（50,000 个细胞 / 孔）于 37°C、5% CO₂条件下培养 24 小时。去除细胞培养基后，用不同浓度的 dBRD9 和 VZ185 PROTAC 化合物处理细胞。处理过夜后，去除细胞培养基，并向每个孔中加入 50µL 补充的 4 号裂解缓冲液（1X）。细胞裂解后，将 16µL 裂解物转移到 384 孔小体积白色微孔板中，并使用总 BRD9 或总 BRD7 检测试剂加入 4µL HTRF 检测抗体。孵育过夜后记录 HTRF 信号。

这些结果表明，VZ185 可诱导 BRD9 和 BRD7 的剂量依赖性减少，而 dBRD9 仅诱导 BRD9 的剂量依赖性减少。在相同条件下，GAPDH 保持稳定（数据未显示）。这一结果证实了 dBRD9 介导的选择性 BRD9 降解，如 Remillard 等人（《德国应用化学国际版》，2017 年）和 Zoppi 等人（《药物化学杂志》，2019 年）所描述。

使用敲除 HAP1 细胞系验证 HTRF 总 BRD7 检测的特异性

使用 HTRF 总 BRD7 试剂盒评估 HAP1 细胞（野生型）和五种敲除了 BRD9、BRD7（家族 IV）、BRD2、BRD3 或 BRD4（BET 家族）的 HAP1 不同细胞系中 BRD7 的表达水平。细胞密度先前已优化，以确保在试剂盒的动态范围内进行 HTRF 检测（数据未显示）。

将 6 种不同的细胞系接种到 96 孔板中（50,000 个细胞 / 孔），在 37°C、5% CO₂条件下培养 24 小时。去除培养基后，用 50µL 补充的 4 号裂解缓冲液（1X）裂解细胞，然后将 16µL 细胞裂解物转移到小体积白色微孔板中，接着加入 4µL 预混合的检测试剂。在室温下孵育过夜后记录 HTRF 信号。

在 HAP1 BRD7 敲除细胞中，HTRF 信号与非特异性信号（虚线）相当，表明 BRD7 基因完全沉默，而正如预期的那样，在其他细胞系中能很好地检测到 BRD7 水平。这一结果证实了 HTRF BRD7 试剂盒对 BRD9 的选择性，尽管这两种蛋白质具有超过 50% 的序列同源性。

请注意，与野生型细胞系相比，HAP1 BRD 敲除细胞系中 BRD7 的表达水平显著更高，这可能表明存在补偿机制。

细胞系参考目录（Horizon Discovery）：HAP1 野生型 #C631；HAP1 BRD9 敲除 #HZGHC000934c003；HAP1 BRD7 敲除 #HZGHC000923c010；HAP1 BRD2 敲除 #HZGHC000356c015；HAP1 BRD3 敲除 #HZGHC000244c004；HAP1 BRD4 敲除 #HZGHC000937c007。

HTRF 总 BRD7 检测与蛋白质印迹法的比较

MCF7 细胞在 T175 培养瓶中的完全培养基中于 37°C、5% CO₂条件下培养。孵育 48 小时后，去除细胞培养基，用 3mL 补充的 4 号裂解缓冲液（1X）在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。

使用补充的 4 号裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，并将 16µL 每种稀释液转移到小体积白色微孔板中，然后加入 4µL HTRF 总 BRD7 检测试剂。

使用等量的裂解物进行 HTRF 与蛋白质印迹法的平行比较。

在这些条件下，HTRF 总 BRD7 检测的灵敏度是蛋白质印迹技术的 8 倍。

简化通路

含溴结构域蛋白 7（BRD7）是溴结构域含蛋白家族 IV 的成员。据报道，在某些癌症中，如上皮性卵巢癌、乳腺癌、鼻咽癌和结直肠癌，BRD7 的表达下调。

BRD7 与 p110/p85 的相互作用竞争，并促进 p85 的核转位，通过其调节 X 盒结合蛋白 1（XBP1）核转位的能力实现未折叠蛋白反应（UPR）信号传导。

BRD7 依赖的胞质中 p85 耗竭会阻碍 PI3 激酶复合体的形成，导致 PI3K 活性降低。因此，BRD7 间接下调参与多种癌症相关过程（包括细胞凋亡、蛋白质合成、增殖和血管生成）的关键通路。

规格

应用：细胞信号传导

兼容自动化：是

品牌：HTRF

检测方式：HTRF

兼容的裂解缓冲液：1 号裂解缓冲液、4 号裂解缓冲液

分子修饰：总蛋白

产品类别：试剂盒

样品体积：16µL

运输条件：干冰运输

靶标类别：磷蛋白

靶标物种：人、小鼠

技术：时间分辨荧光共振能量转移

治疗领域：肿瘤学与炎症

单位规格：10,000 个检测点

没有数据

货号：64BRD7TPEH

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