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HTRF (H/M) BRD9 TOTAL KIT - 50K PTS

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品牌： Revvity

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概述

BRD9（含 BRD9 溴域蛋白 9）是溴域蛋白家族 IV 的成员，该家族还包括 BRD7。BRD9 是 SWI/SNF（GBAF 或 ncBAF）复合体的一个亚基，可结合组蛋白的乙酰化赖氨酸残基，介导染色质重塑和转录调控。BRD9 参与多能性调控和细胞发育过程。

BRD9 的过表达与神经发育障碍以及急性髓系白血病等癌症相关。近年来，通过 PROTAC 分子靶向降解 BRD9 已成为一种新颖且具有前景的治疗方法。然而，BRD9 和 BRD7 蛋白具有 72% 的残基相似性，因此化合物可能同时靶向原癌基因 BRD9 和抑癌基因 BRD7。因此，必须仔细研究靶向 BRD9 或 BRD7 的化合物的选择性。为此，HTRF 总 BRD7 检测试剂盒是 HTRF 总 BRD9 检测试剂盒的重要配套检测工具，可实现可靠的化合物谱分析。

工作原理

总 BRD9 检测原理

HTRF 总 BRD9 检测可定量细胞裂解物中 BRD9 的表达水平。与蛋白质印迹法不同，该检测完全基于微孔板，不需要凝胶、电泳或转膜步骤。总 BRD9 检测使用两种标记抗体：一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。两种抗体都对蛋白质上的不同表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在 BRD9 时，添加这些偶联物会使供体荧光团与受体荧光团接近，从而产生 FRET 信号。其强度与样品中蛋白质的浓度直接成正比，并提供了一种在无需洗涤的检测形式下评估蛋白质表达的方法。

总 BRD9 双板检测方案

双板方案包括在 96 孔板中培养细胞，然后裂解，接着将裂解物转移到 384 孔小体积检测板中，再添加总 BRD9 HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

总 BRD9 单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测总 BRD9 可在单个用于培养、刺激和裂解的板中进行。无需洗涤步骤。这种高通量筛选设计的方案能够实现微型化，同时保持稳定的 HTRF 质量。

检测验证

多种人和小鼠细胞系的验证

将贴壁的人细胞系 MCF7 和 MDA-MB-543 细胞（乳腺）、HELA 细胞（宫颈）、SH-SY5Y 细胞（骨髓神经母细胞瘤）以及小鼠细胞系 NIH3T3 和 Neuro2A 以 100,000 个细胞 / 孔的密度接种在 96 孔培养板中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时。去除培养基后，用 50µL 补充的 4 号裂解缓冲液（1X）裂解细胞。

将悬浮的人免疫 PL-21 细胞系（急性髓系白血病）以 30µL 的量分配到 96 孔板中，密度为 100,000 个细胞 / 孔，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 1 小时，然后用 10µL 补充的 4 号裂解缓冲液（4X）裂解。

使用 HTRF 总 BRD9 试剂盒评估 BRD9 的表达水平。简要来说，将 16µL 细胞裂解物转移到小体积白色微孔板中，然后加入 4µL 预混合的 HTRF 检测试剂。在室温下孵育过夜后记录 HTRF 信号。虚线对应非特异性 HTRF 信号。请注意，之前已对细胞密度进行了优化，以确保在试剂盒的动态范围内进行 HTRF 检测（数据未显示）。

HTRF 总 BRD9 检测能有效检测各种表达不同水平该蛋白的细胞模型中的 BRD9。

PROTAC® 诱导的 BRD9 降解

MCF7 细胞上的 HTRF 总 BRD9 检测 - GAPDH 药理学验证

HELA 细胞上的 HTRF 总 BRD9 检测 - PROTAC 药理学验证

HELA 细胞上的 HTRF 总 BRD9 检测 - GAPDH 药理学验证

MCF7 和 HeLa 细胞在 96 孔板中（50,000 个细胞 / 孔）于 37°C、5% CO₂条件下培养 24 小时。去除细胞培养基后，用递增浓度的 PROTAC 化合物 dBRD9 和 VZ185 以及作为阴性无关对照的 PROTAC ARV-471（PROTAC 雌激素受体）处理细胞。过夜孵育后，去除细胞培养基，向每个孔中加入 50µL 补充的 4 号裂解缓冲液（1X）。细胞裂解后，将 16µL 裂解物转移到 384 孔小体积白色微孔板中，并加入 4µL HTRF BRD9 检测抗体。过夜孵育后记录 HTRF 信号。

在两种细胞类型中，两种 BRD9 PROTAC 降解剂均触发 BRD9 蛋白的剂量依赖性减少，而在 ARV-471 对照条件下 BRD9 的表达水平以及 GAPDH 均保持稳定。这些结果表明 PROTAC 诱导了特异性的 BRD9 降解，DC50 * 在 nM 范围内，与预期一致（Remillard 等人，《德国应用化学国际版》，2017 年；Zoppi 等人，《药物化学杂志》，2019 年）。

DC50 对应于使 50% 的靶蛋白降解的降解剂浓度。

PROTAC® 对 BRD9 和 BRD7 的谱分析

由于 BRD9 是一种癌基因，而 BRD7 起着肿瘤抑制因子的作用，因此选择性降解 BRD9 而非 BRD7 具有重要意义。

HeLa 细胞在 96 孔板中（50,000 个细胞 / 孔）于 37°C、5% CO₂条件下培养 24 小时。去除细胞培养基后，用递增浓度的 dBRD9 和 VZ185 PROTAC 化合物处理细胞。过夜处理后，去除细胞培养基，向每个孔中加入 50µL 补充的 4 号裂解缓冲液（1X）。细胞裂解后，将 16µL 裂解物转移到 384 孔小体积白色微孔板中，并加入 4µL HTRF 检测抗体，使用总 BRD9 或总 BRD7 检测试剂。过夜孵育后记录 HTRF 信号。

这些结果表明，VZ185 诱导 BRD9 和 BRD7 的剂量依赖性减少，而 dBRD9 仅诱导 BRD9 的剂量依赖性减少。在相同条件下，GAPDH 保持稳定（数据未显示）。这一结果证实了 dBRD9 介导的选择性 BRD9 降解，如 Remillard 等人（《德国应用化学国际版》，2017 年）和 Zoppi 等人（《药物化学杂志》，2019 年）所描述的。

使用敲除 HAP1 细胞系的 HTRF 总 BRD9 检测的特异性

使用 HTRF 总 BRD9 试剂盒评估 HAP1 细胞（野生型）和五种敲除了 BRD9、BRD7（家族 IV）、BRD2、BRD3 或 BRD4（BET 家族）的不同 HAP1 细胞系中的 BRD9 表达水平。之前已对细胞密度进行了优化，以确保在试剂盒的动态范围内进行 HTRF 检测（数据未显示）。

将 6 种不同的细胞系在 96 孔板中（50,000 个细胞 / 孔）于 37°C、5% CO₂条件下培养 24 小时。去除培养基后，用 50µL 补充的 4 号裂解缓冲液（1X）裂解细胞，然后将 16µL 细胞裂解物转移到小体积白色微孔板中，接着加入 4µL 预混合的检测试剂。在室温下过夜孵育后记录 HTRF 信号。

在 HAP1 BRD9 敲除细胞中，HTRF 信号与非特异性信号（虚线）相当，表明 BRD9 基因完全沉默，而正如预期的那样，在其他细胞系中能很好地检测到 BRD9 水平。

请注意：i）在 HAP1 BRD3 敲除细胞系中，BRD9 表达水平显著更高，表明存在补偿机制；ii）野生型和 BRD7 敲除细胞系中 BRD9 的表达水平相似，这表明 HTRF BRD9 试剂盒对 BRD7 具有选择性，因为这两种蛋白质共享超过 50% 的序列同源性。

目录细胞系参考（Horizon Discovery）：HAP1 野生型 #C631；HAP1 BRD9 敲除 #HZGHC000934c003；HAP1 BRD7 敲除 #HZGHC000923c010；HAP1 BRD2 敲除 #HZGHC000356c015；HAP1 BRD3 敲除 #HZGHC000244c004；HAP1 BRD4 敲除 #HZGHC000937c007。

HTRF 总 BRD9 检测与蛋白质印迹法的比较

MCF7 细胞在 T175 培养瓶中的完全培养基中于 37°C、5% CO₂条件下培养。孵育 48 小时后，去除细胞培养基，用 3mL 补充的 4 号裂解缓冲液（1X）裂解细胞，在室温下轻轻摇晃 30 分钟。

使用补充的 4 号裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，将 16µL 每种稀释液转移到小体积白色微孔板中，然后加入 4µL HTRF 总 BRD9 检测试剂。

使用等量的裂解物进行 HTRF 和蛋白质印迹法的平行比较。

在这些条件下，HTRF 总 BRD9 检测的灵敏度是蛋白质印迹技术的 8 倍。

HTRF 和蛋白质印迹法中 dBRD9 PROTAC 的药理学

MCF7 细胞在 96 孔板中（50,000 个细胞 / 孔）于 37°C、5% CO₂条件下培养 24 小时。去除细胞培养基后，用递增浓度的 dBRD9 处理细胞。过夜处理后，去除细胞培养基，向每个孔中加入 50µL 补充的 4 号裂解缓冲液（1X）。使用 16µL 相同的细胞裂解物，按照各自的方案进行总 HTRF BRD9 检测和蛋白质印迹检测。

两种技术均显示 dBRD9 诱导 BRD9 的剂量依赖性减少，且 DC50 具有相关性（HTRF 为 40nM，蛋白质印迹法为 90nM），而 GAPDH 的表达水平保持稳定（数据未显示）。

两种技术均显示 dBRD9 诱导 BRD9 的剂量依赖性减少，且 DC50 具有相关性，而 GAPDH 的表达水平保持稳定（数据未显示）。

简化通路

BRD9 是一种 GBAF（或 ncBAF）重塑复合体亚基，与 GLTSCR1/1L 蛋白特异性相关。BRD9 结合乙酰化的组蛋白，导致染色质重塑和基因转录调控，如 cMyc（凋亡调节因子）和 SOCS3（STAT5 通路调节因子）（1,2）。

最近的研究表明，BRD9 的表达受 KRAS 和 PI3K 通路调控（2）。BRD4 以溴域依赖的方式介导 GBAF 复合体亚基向染色质的募集（1,3）。

此外，已有报道称 BRD9 作为转录激活因子在干扰素刺激基因（ISGs）的 IRF9 依赖性表达中发挥关键作用，这也涉及 STAT2 和 STAT1 蛋白（4）。

（1）：Innis 等人，《表观遗传学与染色质》，2020 年
（2）：Zhu 等人，《肿瘤靶点与治疗》，2020 年
（3）：Gatchalian 等人，2018 年
（4）：Borold 等人，《欧洲分子生物学组织报告》，2021 年

规格

其他规格	详情
应用	细胞信号传导
兼容自动化	是
品牌	HTRF
检测方式	HTRF
裂解缓冲液兼容性	1 号裂解缓冲液、2 号裂解缓冲液、3 号裂解缓冲液、4 号裂解缓冲液
分子修饰	总量
产品类别	试剂盒
样品体积	16µL
运输条件	干冰运输
靶标类别	磷蛋白
靶标物种	人、小鼠
技术	时间分辨荧光共振能量转移
治疗领域	肿瘤学与炎症
单位规格	500 个检测点

没有数据

货号：64BRD9TPEY

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