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HTRF BCATENIN P-T41/S33/37 KIT - 10K PTS

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概述

磷酸化 β- 连环蛋白（Thr41/Ser37/Ser33）检测试剂盒可对 GSK3β 诱导的 β- 连环蛋白在 Thr41/Ser37/Ser33 位点的磷酸化进行可靠检测，以此作为经典 Wnt 通路的读数。β- 连环蛋白在 Thr41/Ser37/Ser33 位点的磷酸化意味着该蛋白处于失活形式，会被蛋白酶体降解。

工作原理

磷酸化 β- 连环蛋白（Thr41/Ser37/Ser33）检测原理

磷酸化 β- 连环蛋白（Thr41/Ser37/Ser33）检测用于测量在 Thr41/Ser37/Ser33 位点发生磷酸化的连环蛋白。与蛋白质印迹法不同，该检测完全基于微孔板，无需凝胶、电泳或转膜操作。磷酸化 β- 连环蛋白（Thr41/Ser37/Ser33）检测使用两种标记抗体：一种带有供体荧光团，另一种带有受体荧光团。第一种抗体经过筛选，能够特异性结合蛋白质上的磷酸化基序，第二种抗体则能不依赖蛋白质的磷酸化状态对其进行识别。蛋白质磷酸化会促使形成包含两种标记抗体的免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团靠近，进而产生 FRET 信号。信号强度与样品中磷酸化蛋白质的浓度直接成正比，并能在免洗涤的检测形式下为评估蛋白质的磷酸化状态提供方法。

磷酸化 β- 连环蛋白（Thr41/Ser37/Ser33）检测原理

磷酸化 β- 连环蛋白（Thr41/Ser37/Ser33）双板检测方案

双板方案的流程为：先在 96 孔板中培养细胞，然后进行裂解，再将裂解物转移到 384 孔小体积检测板中，之后添加磷酸化 β- 连环蛋白 HTRF 检测试剂。该方案能够对细胞的活力和汇合度进行监测。

磷酸化 β- 连环蛋白（Thr41/Ser37/Ser33）双板检测方案

磷酸化 β- 连环蛋白（Thr41/Ser37/Ser33）单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测磷酸化 β- 连环蛋白可在单个用于培养、刺激和裂解的培养板中完成。无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现微型化操作，同时保持稳定的 HTRF 检测质量。

磷酸化 β- 连环蛋白（Thr41/Ser37/Ser33）单板检测方案

检测验证

采用磷酸化 β- 连环蛋白和总 β- 连环蛋白细胞检测的 HTRF 检测与蛋白质印迹法的比较

将人 HEK293 细胞在 T175 培养瓶中于 37°C、5% CO₂条件下培养至 80% 汇合度，并用 5µM 的 MG132 处理 3 小时。弃去细胞培养基，加入 3mL 补充的裂解缓冲液，在室温下孵育 30 分钟。离心 10 分钟后收集可溶性上清液。在补充的裂解缓冲液中对细胞裂解物进行系列稀释，取 16µL 每种稀释液分别通过蛋白质印迹法和 HTRF 进行平行分析。HTRF 磷酸化 β- 连环蛋白（T41/S33/S37）检测与蛋白质印迹法（WB）的灵敏度相当，而 HTRF 总 β- 连环蛋白检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 9 倍。

采用磷酸化和总 β- 连环蛋白检测的 HTRF 与蛋白质印迹法比较

采用磷酸化 β- 连环蛋白和总 β- 连环蛋白细胞检测在 HEK293 细胞上进行 GSK3 抑制剂 BIO 的剂量反应研究

将 200,000 个人 HEK293 细胞接种到 96 孔板中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时。随后用 MG-132 和浓度递增的 BIO 处理细胞 3 小时。为裂解细胞，加入 50µL 裂解缓冲液，在室温下轻轻振荡 30 分钟。将 16µL 裂解物转移到 384 孔小体积白色微孔板中，加入 4µL HTRF 磷酸化 β- 连环蛋白和总 β- 连环蛋白检测试剂。过夜孵育后记录 HTRF 信号。

在 HEK293 细胞上对磷酸化和总 β- 连环蛋白检测的验证

HTRF 磷酸化 β- 连环蛋白细胞检测与不同细胞系的兼容性

将细胞以不同的细胞密度接种到 96 孔板中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时。移除培养基，用 50µL 裂解缓冲液在室温下轻轻振荡 30 分钟以裂解细胞。将 16µL 裂解物转移到 384 孔小体积白色微孔板中，加入 4µL HTRF 磷酸化 β- 连环蛋白检测试剂。过夜孵育后记录 HTRF 信号。HTRF 对 β- 连环蛋白表达水平的定量结果与文献（Sadot 等人，《细胞科学杂志》，2002 年）高度一致。SW-480 细胞中的 β- 连环蛋白含量几乎是 HCT-116 细胞的 2.5 倍，是 HEK-293 细胞的 15 倍。

在 HCT-116、SW-480 和 HEK293 细胞上对磷酸化 β- 连环蛋白检测的验证

采用 HTRF 磷酸化 β- 连环蛋白和总 β- 连环蛋白细胞检测测量 MG-132 对蛋白酶体活性的抑制作用

将 200,000 个人 HEK293 细胞接种到 96 孔板中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时。然后用浓度递增的 MG-132 在不同时间点处理细胞。为裂解细胞，加入 50µL 裂解缓冲液，在室温下轻轻振荡 30 分钟。将 16µL 裂解物转移到 384 孔小体积白色微孔板中，加入 4µL HTRF 磷酸化 β- 连环蛋白和总 β- 连环蛋白检测试剂。过夜孵育后记录 HTRF 信号。

采用 HTRF 磷酸化 β- 连环蛋白检测测量 MG-132 对蛋白酶体活性的抑制作用

采用 HTRF 总 β- 连环蛋白检测测量 MG-132 对蛋白酶体活性的抑制作用

简化通路

β- 连环蛋白在经典 Wnt 通路中的作用

在没有细胞外 WNT 配体的情况下，胞质中的 β- 连环蛋白在 Thr41/Ser37/Ser33 位点发生磷酸化，进而被泛素化、降解并失活。细胞外 WNT 配体与 Frizzled 受体和 / 或低密度脂蛋白受体相关蛋白 LRP5 和 LRP6 结合后，通过激活散乱蛋白 DVL 家族蛋白将信号传导至细胞内。这会导致破坏复合体失活，使胞质中未磷酸化的 β- 连环蛋白积累，随后转运至细胞核内。

β- 连环蛋白在经典 Wnt 通路中的作用

规格

其他规格

应用：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
兼容的裂解缓冲液：3 号裂解缓冲液、4 号裂解缓冲液、5 号裂解缓冲液
分子修饰：磷酸化
产品类别：试剂盒
样品体积：16µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷蛋白
靶标物种：人、小鼠
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域：代谢 / 糖尿病、肿瘤学与炎症
单位规格：10,000 个检测点

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货号：64CATPEH

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