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HTRF STING TOTAL KIT - 50K PTS

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概述

总 STING 细胞检测可监测总 STING 的水平，并且能与我们的磷酸化 STING 试剂盒配合用作归一化检测。该试剂盒与磷酸化 STING 试剂盒的缓冲液兼容，因此可使用相同的裂解物来分析磷酸化蛋白和总蛋白群体。

在病原体感染以及双链 DNA（dsDNA）与细胞质传感器 cGAS 结合后，STING 蛋白会被 TBK1 磷酸化，使其能够与 IRF3 结合，进而诱导 I 型干扰素的产生。随后，STING 通路会通过自噬相关的 STING 降解过程被关闭。

在免疫肿瘤学领域，激活 STING 通路在临床前模型中已显示出良好的抗肿瘤效果，因此这代表了一种治疗人类癌症的潜在治疗策略。

工作原理

总 STING 检测原理

总 STING 检测可定量细胞裂解物中 STING 的表达水平。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。总 STING 检测使用两种标记抗体：一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。两种抗体均对该蛋白上的特定表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在 STING 时，添加这些偶联物会使供体荧光团与受体荧光团接近，从而产生 FRET 信号。其强度与样品中蛋白质的浓度直接成正比，且无需洗涤步骤即可评估蛋白质的表达水平。

总 STING 双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，然后进行裂解，接着将裂解物转移到 384 孔小体积检测板中，之后再加入总 STING HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

总 STING 单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测总 STING 可在单个板中完成，该板可用于细胞培养、刺激和裂解。无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现小型化，同时保持稳定的 HTRF 质量。

检测验证

2’-3’- 环磷酸鸟苷 - 腺苷（cGAMP）诱导 THP1 细胞中 STING 的磷酸化

将人 THP1-R232 细胞（来自 Invivogen 公司）以 25µL 的体积接种到 96 孔板中（400,000 个细胞 / 孔），使用完全培养基培养。用不同浓度的 2’3’cGAMP（5µL，处理 4 小时）刺激细胞。然后加入 10µL 4X 的补充裂解缓冲液 #4，在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。将 16µL 裂解物转移到 384 孔小体积白色微孔板中，然后加入 4µL HTRF® 磷酸化 STING 或总 STING 检测抗体。同时，使用相应的 HTRFα- 微管蛋白内参试剂盒，从 4µL 细胞裂解物中分析 α- 微管蛋白内参蛋白。最后，在室温下孵育过夜后记录 HTRF 信号。

如其他文献所述，2’3’cGAMP 诱导 STING 通路显著激活，导致 STING 磷酸化水平增加 6 倍。诱导的 STING 磷酸化与 STING 表达水平下调相关，这与自噬介导的降解一致，而在相同条件下 α- 微管蛋白保持稳定。

HTRF 磷酸化和总 STING 检测可准确定量激动剂诱导的 STING 调控

将 400,000 个 THP1-R232 细胞（来自 Invivogen 公司）以 25µL 的体积接种到 96 孔板中，使用完全培养基培养。用不同浓度的 2’3’cGAMP（5µL，处理 4 小时）刺激细胞。然后加入 10µL 4X 的补充裂解缓冲液 #4，在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。取 16µL 裂解物分别通过 HTRF 和蛋白质印迹法进行平行分析。

通过 HTRF 进行的信号定量能够对化合物效果进行准确的统计分析，如下图所示，400µM 的 cGAMP 显著降低了总 STING 和磷酸化 STING 的水平（使用的统计方法：单因素方差分析，P 值 < 0.0001）。

总 STING 细胞检测与蛋白质印迹法的比较

将人 THP1-R232 细胞系接种到 T175 培养瓶的完全培养基中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 2 天。然后用 100µM 2’3’cGAMP 刺激细胞 4 小时，并用 3mL 补充的裂解缓冲液 #4 在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。离心 10 分钟后收集可溶性上清液。

用补充的裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，将 16µL 各稀释液转移到小体积白色微孔板中，然后加入 4µL HTRF 总 STING 检测抗体。使用等量的裂解物对 HTRF 和蛋白质印迹法进行平行比较。

使用总 STING 试剂盒时，每孔 4,000 个细胞通过 HTRF 和蛋白质印迹法都足以检测到显著信号。因此，在我们的实验中，两种方法对总 STING 蛋白的检测灵敏度相近。

简化通路

STING 简化通路

STING，即干扰素基因刺激因子，是一种定位于内质网的细胞质同源二聚体蛋白，在先天免疫中发挥重要作用。在病原体感染或细胞凋亡过程中线粒体收缩时，游离的双链 DNA 会结合并激活 DNA 传感器 —— 环磷酸鸟苷 - 腺苷合成酶（cGAS）。激活的 cGAS 会促使 2’-3’cGAMP（一种环二核苷酸）的产生，随后 2’-3’cGAMP 与 STING 蛋白结合。反过来，磷酸化的 STING 会与 TANK 结合激酶 1（TBK1）相互作用，进而招募并激活活性干扰素调节因子（IRF3）二聚体。IRF3 二聚体进入细胞核后，会诱导编码 IFN-α/β 的基因转录。此外，STING 通路还调控 NF-κB 依赖性炎症细胞因子的表达。作为负反馈循环，DNA 刺激的 cGAS-STING-TBK1 通路还会通过 p62 SQSTM1 相关的自噬触发 STING 蛋白降解，从而关闭 IFNβ 的产生。

规格参数

其他规格参数

应用领域：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
分子修饰：总蛋白
产品类别：试剂盒
样品体积：16 µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷蛋白
靶标物种：人
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域：传染病、肿瘤学与炎症
单位规格：50,000 个检测点

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货号：64NTGPEY

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