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HTRF CDK2 TOTAL KIT - 50K PTS

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概述

总 CDK2 细胞检测可监测总 CDK2 水平，且能与我们的磷酸化 CDK2（Tyr15）试剂盒配合使用，作为归一化检测。该试剂盒与磷酸化 CDK2 试剂盒的缓冲液兼容，因此同一份裂解物可用于分析磷酸化蛋白和总蛋白群体。

CDK2（细胞周期蛋白依赖性激酶 2）是协调哺乳动物细胞周期进程的 CDK 亚家族成员之一（还包括 CDK1、CDK4 和 CDK6）。CDK2 分别在 G1 期晚期和 S 期通过与细胞周期蛋白 E 和细胞周期蛋白 A 相互作用而被激活，并且还受两个主要磷酸化位点的调控。激酶 Wee1 在 Tyr15 位点的磷酸化会通过阻止 ATP 结合而产生抑制作用，而磷酸酶 Cdc25A 对 Tyr15 的去磷酸化以及 CAK（CDK 激活激酶）在 Thr160 位点的磷酸化则是其完全激活所必需的。

Tyr15 位点的 CDK2 抑制性磷酸化对于维持基因组完整性和防止 S 期 DNA 损伤至关重要。因此，Wee1/Cdc25A 轴是癌症治疗的一个极具吸引力的靶点，并且可能代表一种使具有过度活跃 CDK2 的癌细胞敏感的独特方法。

工作原理

总 CDK2 检测原理

总 CDK2 检测可定量细胞裂解物中 CDK2 的表达水平。与蛋白质印迹法不同，该检测完全基于微孔板，不需要凝胶、电泳或转膜步骤。总 CDK2 检测使用两种标记抗体，一种偶联有供体荧光团，另一种偶联有受体荧光团。两种抗体都对蛋白质上的不同表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在 CDK2 时，添加这些偶联物会使供体荧光团与受体荧光团接近，从而产生 FRET 信号。其强度与样品中蛋白质的浓度直接成正比，并提供了一种在无需洗涤的检测形式下评估蛋白质表达的方法。

HTRF 总 CDK2 检测原理

总 CDK2 双板检测方案

双板方案包括先在 96 孔板中培养细胞，然后裂解细胞，再将裂解物转移到 384 孔小体积检测板中，之后添加总 CDK2 HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

HTRF 总 CDK2 检测的双板方案

总 CDK2 单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测总 CDK2 可在单个用于培养、刺激和裂解的板中进行。无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现小型化，同时保持稳定的 HTRF 质量。

HTRF 总 CDK2 检测的单板方案

检测验证

通过 siRNA 实验验证总 CDK2、总 CDK4 和总 CDK6 检测的特异性

将 HeLa 细胞和 HEK293 细胞接种到 96 孔板中（分别为 40,000 和 50,000 个细胞 / 孔），培养 24 小时。然后用针对 CDK1、CDK2、CDK4 或 CDK6 的特异性 siRNA 以及阴性对照 siRNA 转染细胞。孵育 48 小时后，裂解细胞，并将 16 µL 裂解物转移到 384 孔小体积白色微孔板中，然后添加 4 µL HTRF 总 CDK2、总 CDK4 或总 CDK6 检测抗体。 overnight 孵育后记录 HTRF 信号。

与转染阴性 siRNA 的细胞相比，用每种特异性 CDK2、CDK4 或 CDK6 siRNA 转染的细胞，其信号降低了 77% 至 97%。值得注意的是，当细胞用 CDK2 siRNA 转染时，在总 CDK6 检测中观察到的微小信号降低是预期的，因为 CDK2 敲低会导致 CDK6 的下调（Bačević等人，《科学报告》，2017；7:13429）。综上所述，这些数据表明 HTRF 总 CDK2、总 CDK4 和总 CDK6 检测对每种激酶都具有特异性，不会与其他细胞周期 CDK 家族成员发生交叉反应。

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碱性磷酸酶对 CDK2 Tyr15 的去磷酸化作用

将 HeLa 细胞在 T175 培养瓶中培养 48 小时，并用 0.5 µg/mL 阿非迪霉素处理 20 小时。然后用 3 mL 补充的 2 号裂解缓冲液（1X）裂解细胞，仅将部分裂解物用碱性磷酸酶（AP）处理。在检测步骤中，将 16 µL 裂解物转移到 384 孔小体积白色微孔板中，并添加 4 µL HTRF 磷酸化 CDK2（Tyr15）或总 CDK2 检测抗体。 overnight 孵育后记录 HTRF 信号。

正如预期的那样，碱性磷酸酶诱导 CDK2 的 Tyr15 位点几乎完全去磷酸化，而该激酶的总水平不受此处理的调节。

HeLa 细胞中碱性磷酸酶对 CDK2 Tyr15 的去磷酸化作用

使用细胞周期阻滞剂调节磷酸化 CDK2（Tyr15）

将人 HeLa 细胞和小鼠 NIH-3T3 细胞在 96 孔板中（50,000 个细胞 / 孔）培养 24 小时，然后分别用细胞周期阻滞剂阿非迪霉素和诺考达唑处理 16 小时。

细胞裂解后，将 16 µL 裂解物转移到 384 孔小体积白色微孔板中，并添加 4 µL HTRF 磷酸化 CDK2（Tyr15）或总 CDK2 检测抗体。 overnight 孵育后记录 HTRF 信号。

正如预期的那样，阿非迪霉素（可将细胞阻滞在 S 期早期）诱导抑制性位点 Tyr15 处的磷酸化 CDK2 呈剂量依赖性积累。

相反，诺考达唑（可将细胞阻滞在 G2/M 期交界处）诱导 Tyr15 位点的 CDK2 磷酸化呈剂量依赖性降低。

无论细胞如何处理，该激酶的表达水平都保持相对稳定。

阿非迪霉素对 HeLa 细胞中磷酸化 CDK2（Tyr15）的调节作用

诺考达唑对 NIH-3T3 细胞中磷酸化 CDK2（Tyr15）的调节作用

使用 Wee1 激酶抑制剂抑制磷酸化 CDK2（Tyr15）

将 HeLa 细胞在 96 孔板中（50,000 个细胞 / 孔）培养 24 小时，然后用 Wee1 激酶抑制剂 Adavosertib 和 PD0166285 处理 2 小时。

细胞裂解后，将 16 µL 裂解物转移到 384 孔小体积白色微孔板中，并添加 4 µL HTRF 磷酸化 CDK2（Tyr15）或总 CDK2 检测抗体。 overnight 孵育后记录 HTRF 信号。

正如预期的那样，两种 Wee1 激酶抑制剂都触发了 Tyr15 位点的磷酸化 CDK2 呈剂量依赖性降低，而蛋白质的表达水平不受这些处理的调节。

Adavosertib 对 HeLa 细胞中磷酸化 CDK2（Tyr15）的抑制作用

PD0166285 对 HeLa 细胞中磷酸化 CDK2（Tyr15）的抑制作用

HTRF 总 CDK2 检测与蛋白质印迹法的比较

将 HeLa 细胞在 T175 培养瓶中的完全培养基中于 37°C、5% CO₂条件下培养。孵育 48 小时后，用 3 mL 补充的 2 号裂解缓冲液（1X）在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。

使用补充的裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，将 16 µL 每种稀释液转移到小体积白色微孔板中，然后添加 4 µL HTRF 总 CDK2 检测试剂。使用等量的裂解物进行 HTRF 和蛋白质印迹法的平行比较。

使用 HTRF 总 CDK2 检测时，800 个细胞 / 孔就足以检测到显著信号，而使用蛋白质印迹法则需要 1,600 个细胞才能获得最小的化学发光信号。因此，在这些条件下，HTRF 总 CDK2 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的两倍。

HTRF 总 CDK2 试剂盒与蛋白质印迹法的比较

简化通路

CDK2 在细胞分裂周期中的作用

CDK2（细胞周期蛋白依赖性激酶 2）是协调哺乳动物细胞周期进程的 CDK 亚家族成员之一（还包括 CDK1、CDK4 和 CDK6）。

有丝分裂原信号（如生长因子）通过诱导细胞周期蛋白 D 的合成，触发细胞进入细胞周期的 G1 期，从而导致活性 CDK4/6 - 细胞周期蛋白 D 复合物的形成。CDK4 和 CDK6 使视网膜母细胞瘤（RB）蛋白发生单磷酸化，此时 RB 蛋白仍与转录因子 E2F 结合，但一些基因（如细胞周期蛋白 E）可以被转录。在 G1 期晚期和 S 期早期，细胞周期蛋白 E 与 CDK2 相互作用并激活它，进而使 RB 蛋白上的其他位点磷酸化，导致其完全失活。因此，S 期进程所需的 E2F 应答基因被诱导，例如细胞周期蛋白 A，它随后与 CDK2 相互作用形成细胞周期蛋白 A/CDK2 复合物。激活的 CDK2 最终使 Cdc25B 和 Cdc25C 磷酸酶磷酸化，而这两种磷酸酶又会激活 CDK1，CDK1 是细胞分裂周期中 G2 期和 M 期进程所必需的。

总 CDK2 信号通路

规格

其他规格

应用：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
分子修饰：总蛋白
产品类别：试剂盒
样品体积：16 µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷酸蛋白
靶标物种：人、小鼠
技术：TR-FRET
治疗领域：肿瘤学与炎症
单位规格：50,000 个检测点

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货号：64CDK2TPEY

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