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HTRF CDK2 P-Y15 KIT - 500 PTS 磷酸化细胞周期蛋白依赖性激酶2蛋白（酪氨酸15）检测试剂盒

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概述

这种基于 HTRF 的细胞检测方法可便捷、准确地检测酪氨酸 15（Tyr15）位点磷酸化的 CDK2。

CDK2（细胞周期蛋白依赖性激酶 2）是协调哺乳动物细胞周期进程的 CDK 亚家族成员（该亚家族还包括 CDK1、CDK4 和 CDK6）。CDK2 分别在 G1 期晚期和 S 期通过与周期蛋白 E 和周期蛋白 A 相互作用而被激活，并且还受两个主要磷酸化位点的调控。激酶 Wee1 在 Tyr15 位点的磷酸化具有抑制作用，可阻止 ATP 结合；而磷酸酶 Cdc25A 对 Tyr15 位点的去磷酸化以及 CDK 激活激酶（CAK）在苏氨酸 160（Thr160）位点的磷酸化是其完全激活所必需的。

Tyr15 位点的 CDK2 抑制性磷酸化对于维持基因组完整性和防止 S 期 DNA 损伤至关重要。因此，Wee1/Cdc25A 轴成为癌症治疗的一个极具吸引力的靶点，并且可能代表了一种使具有过度活跃 CDK2 的癌细胞敏感化的独特方法。

工作原理

磷酸化 CDK2（Tyr15）检测原理

磷酸化 CDK2（Tyr15）检测用于测量 Tyr15 位点磷酸化的 CDK2。与蛋白质印迹法不同，该检测完全基于微孔板，无需凝胶、电泳或转膜步骤。该检测使用两种抗体，一种标记供体荧光团，另一种标记受体荧光团。第一种抗体经筛选可特异性结合蛋白质上的磷酸化基序，第二种抗体则能独立于蛋白质的磷酸化状态识别该蛋白质。蛋白质磷酸化会形成涉及两种标记抗体的免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生 FRET 信号。信号强度与样品中磷酸化蛋白质的浓度直接成正比，并在免洗涤的检测格式下为评估蛋白质的磷酸化状态提供了手段。

phospho-CDK2-cellular-kit-1.svg（磷酸化 CDK2 细胞试剂盒 - 1.svg）

磷酸化 CDK2（Tyr15）双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，裂解后将裂解物转移至 384 孔小体积检测板中，再加入磷酸化 CDK2（Tyr15）HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

phospho-CDK2-Tyr15-cellular-kit（磷酸化 CDK2-Tyr15 细胞试剂盒）

磷酸化 CDK2（Tyr15）单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测磷酸化 CDK2（Tyr15）可在单个用于培养、刺激和裂解的培养板中完成。无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案可实现小型化操作，同时保持稳定的 HTRF 质量。

phospho-CDK2-Tyr15-cellular-kit（磷酸化 CDK2-Tyr15 细胞试剂盒）

检测验证

通过 siRNA 敲低实验验证磷酸化 CDK2（Tyr15）检测的特异性

将 HeLa 细胞接种到 96 孔板中（40,000 个细胞 / 孔），培养 24 小时。然后用针对 CDK1、CDK2、CDK4 或 CDK6 的特异性 siRNA 以及阴性对照 siRNA 转染细胞。孵育 24 小时后，移除培养基，用 0.5 µg/mL 的阿非迪霉素处理细胞 20 小时。细胞裂解后，将 16 µL 裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，并加入 4 µL HTRF 磷酸化 CDK2（Tyr15）检测抗体。过夜孵育后记录 HTRF 信号。

与转染阴性对照 siRNA 的细胞相比，转染 CDK2 siRNA 的细胞信号降低了 92%。相反，敲低 CDK1、CDK4 或 CDK6 并未导致任何信号降低，这表明 HTRF 磷酸化 CDK2（Tyr15）检测对 CDK2 磷酸化具有特异性，且不会与其他细胞周期 CDK 家族成员发生交叉反应。

phospho-CDK2-Tyr15-cellular-kit（磷酸化 CDK2-Tyr15 细胞试剂盒）

碱性磷酸酶对 CDK2 Tyr15 位点的去磷酸化作用

将 HeLa 细胞在 T175 培养瓶中培养 48 小时，并用 0.5 µg/mL 的阿非迪霉素处理 20 小时。然后用 3 mL 补充的 2 号裂解缓冲液（1X）裂解细胞，仅取部分裂解物用碱性磷酸酶（AP）处理。在检测步骤中，将 16 µL 裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，并加入 4 µL HTRF 磷酸化 CDK2（Tyr15）或总 CDK2 检测抗体。过夜孵育后记录 HTRF 信号。

正如预期的那样，碱性磷酸酶诱导 CDK2 的 Tyr15 位点几乎完全去磷酸化，而该激酶的总水平未受此处理的影响。

phospho-CDK2-Tyr15-cellular-kit（磷酸化 CDK2-Tyr15 细胞试剂盒）

使用细胞周期阻滞剂调节磷酸化 CDK2（Tyr15）

将人 HeLa 细胞和小鼠 NIH-3T3 细胞在 96 孔板中（50,000 个细胞 / 孔）培养 24 小时，然后分别用细胞周期阻滞剂阿非迪霉素和诺考达唑处理 16 小时。

细胞裂解后，将 16 µL 裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，并加入 4 µL HTRF 磷酸化 CDK2（Tyr15）或总 CDK2 检测抗体。过夜孵育后记录 HTRF 信号。

正如预期的那样，阿非迪霉素（可将细胞阻滞在 S 期早期）诱导抑制性位点 Tyr15 处的磷酸化 CDK2 呈剂量依赖性积累。

相反，诺考达唑（可将细胞阻滞在 G2/M 交界处）诱导 CDK2 的 Tyr15 位点磷酸化呈剂量依赖性降低。

无论细胞接受何种处理，该激酶的表达水平都保持相对稳定。

phospho-CDK2-Tyr15-cellular-kit（磷酸化 CDK2-Tyr15 细胞试剂盒）

phospho-CDK2-Tyr15-cellular-kit-8.svg（磷酸化 CDK2-Tyr15 细胞试剂盒 - 8.svg）

使用 Wee1 激酶抑制剂抑制磷酸化 CDK2（Tyr15）

将 HeLa 细胞在 96 孔板中（50,000 个细胞 / 孔）培养 24 小时，然后用 Wee1 激酶抑制剂阿达沃塞替尼和 PD0166285 处理 2 小时。

细胞裂解后，将 16 µL 裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，并加入 4 µL HTRF 磷酸化 CDK2（Tyr15）或总 CDK2 检测抗体。过夜孵育后记录 HTRF 信号。

正如预期的那样，两种 Wee1 激酶抑制剂均触发 Tyr15 位点的磷酸化 CDK2 呈剂量依赖性降低，而该蛋白的表达水平未受这些处理的影响。

phospho-CDK2-Tyr15-cellular-kit-8.svg（磷酸化 CDK2-Tyr15 细胞试剂盒 - 8.svg）

phospho-CDK2-Tyr15-cellular-kit（磷酸化 CDK2-Tyr15 细胞试剂盒）

HTRF 磷酸化 CDK2（Tyr15）检测与蛋白质印迹法的比较

将 HeLa 细胞在 T175 培养瓶中的完全培养基中于 37°C、5% CO₂条件下培养。孵育 48 小时后，用 0.5 µg/mL 的阿非迪霉素处理细胞 16 小时，然后用 3 mL 补充的 2 号裂解缓冲液（1X）在室温下轻轻振荡 30 分钟以裂解细胞。

使用补充的裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，将 16 µL 每种稀释液转移至小体积白色微孔板中，然后加入 4 µL HTRF 磷酸化 CDK2（Tyr15）检测试剂。使用等量的裂解物对 HTRF 检测与蛋白质印迹法进行平行比较。

使用 HTRF 磷酸化 CDK2（Tyr15）检测时，800 个细胞 / 孔就足以检测到显著信号，而使用蛋白质印迹法则需要 1,600 个细胞才能获得最小的化学发光信号。因此，在这些条件下，HTRF 磷酸化 CDK2 检测的灵敏度是蛋白质印迹技术的 2 倍。

phospho-CDK2-Tyr15-cellular-kit（磷酸化 CDK2-Tyr15 细胞试剂盒）

简化通路

磷酸化 CDK2 在细胞分裂周期中的作用

CDK2（细胞周期蛋白依赖性激酶 2）是协调哺乳动物细胞周期进程的 CDK 亚家族成员（该亚家族还包括 CDK1、CDK4 和 CDK6）。CDK2 分别在 G1 期晚期和 S 期通过与周期蛋白 E 和周期蛋白 A 相互作用而被激活，并且还受两个主要磷酸化位点的调控。激酶 Wee1 在 Tyr15 位点的磷酸化具有抑制作用，可阻止 ATP 结合；而磷酸酶 Cdc25A 对 Tyr15 位点的去磷酸化以及 CDK 激活激酶（CAK）在 Thr160 位点的磷酸化是其完全激活所必需的。

有丝分裂原信号（如生长因子）通过诱导周期蛋白 D 的合成，触发细胞进入细胞周期的 G1 期，进而形成有活性的 CDK4/6 - 周期蛋白 D 复合物。CDK4 和 CDK6 使视网膜母细胞瘤（RB）蛋白发生单磷酸化，此时 RB 仍与转录因子 E2F 结合，但部分基因可被转录，如周期蛋白 E。在 G1 期晚期和 S 期早期，周期蛋白 E 与 CDK2 相互作用并激活 CDK2，CDK2 进而磷酸化 RB 上的其他位点，导致其完全失活。因此，S 期进程所需的 E2F 应答基因被诱导表达，如周期蛋白 A，随后周期蛋白 A 与 CDK2 相互作用形成周期蛋白 A/CDK2 复合物。CDK2 最终磷酸化 Cdc25B 和 Cdc25C 磷酸酶，进而激活 CDK1，而 CDK1 是细胞分裂周期中 G2 期和 M 期进程所必需的。

S 期 CDK2 的活性受到正向和负向调控因素的严格调控：当 CDK2 活性最高时，其 Thr160 位点的磷酸化水平会增加，同时抑制性位点 Tyr15 的磷酸化水平也达到最高。因此，在细胞周期中整体 CDK2 活性增强时，部分 CDK2 分子的活性会受到抑制。相反，在有丝分裂时，Tyr15 位点会突然去磷酸化。

Tyr15 位点的 CDK2 抑制性磷酸化对于维持基因组完整性和防止 S 期 DNA 损伤至关重要。

phospho-CDK2-Tyr15-cellular-kit（磷酸化 CDK2-Tyr15 细胞试剂盒）

规格

其他规格

应用：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
兼容的裂解缓冲液：2 号裂解缓冲液、3 号裂解缓冲液、4 号裂解缓冲液、5 号裂解缓冲液
分子修饰：磷酸化
产品类别：试剂盒
样品体积：16 µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷蛋白
靶标物种：人、小鼠
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域：肿瘤学与炎症
单位规格：500 个检测点

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