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HTRF CDK4 TOTAL KIT - 10K PTS 人源/鼠源总周期蛋白依赖性激酶4检测试剂盒，10,000测试

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概述

总 CDK4 细胞检测可监测 CDK4 蛋白水平。

CDK4（细胞周期蛋白依赖性激酶 4）是协调哺乳动物细胞周期进程的 CDK 亚家族成员（该亚家族还包括 CDK1、CDK2 和 CDK6）。在细胞周期的 G1 期早期，CDK4 通过与周期蛋白 D 相互作用而被激活，并对肿瘤抑制因子视网膜母细胞瘤（RB）蛋白进行单磷酸化，进而启动 G1/S 期转换所需基因的转录。

CDK4 的激活失调会导致细胞分裂失控，这是癌症的一个显著特征。因此，对 CDK4 的抑制是一个活跃的研究领域，尤其是随着蛋白水解靶向嵌合体（PROTACs）等新方法的出现。

工作原理

总 CDK4 检测原理

总 CDK4 检测可对细胞裂解物中 CDK4 的表达水平进行定量。与蛋白质印迹法不同，该检测完全基于微孔板，无需凝胶、电泳或转膜步骤。总 CDK4 检测使用两种标记抗体，一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。两种抗体均对该蛋白上的特定表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在 CDK4 时，加入这些偶联物会使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生 FRET 信号。信号强度与样品中该蛋白的浓度直接成正比，并在免洗涤的检测格式下为评估蛋白的表达水平提供了手段。

total-CDK4-cellular-kit（总 CDK4 细胞试剂盒）

总 CDK4 双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，裂解后将裂解物转移至 384 孔小体积检测板中，再加入总 CDK4 HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

total-CDK4-cellular-kit-2.svg（总 CDK4 细胞试剂盒 - 2.svg）

总 CDK4 单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测总 CDK4 可在单个用于培养、刺激和裂解的培养板中完成。无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案可实现小型化操作，同时保持稳定的 HTRF 质量。

total-CDK4-cellular-kit-3.svg（总 CDK4 细胞试剂盒 - 3.svg）

检测验证

通过 siRNA 实验验证总 CDK2、总 CDK4 和总 CDK6 检测的特异性

将 HeLa 细胞和 HEK293 细胞分别以 40,000 个细胞 / 孔和 50,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔板中，培养 24 小时。然后用针对 CDK1、CDK2、CDK4 或 CDK6 的特异性 siRNA 以及阴性对照 siRNA 转染细胞。孵育 48 小时后，裂解细胞，将 16µL 裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，随后加入 4µL HTRF 总 CDK2、总 CDK4 或总 CDK6 检测抗体。过夜孵育后记录 HTRF 信号。

与转染阴性对照 siRNA 的细胞相比，转染每种特异性 CDK2、CDK4 或 CDK6 siRNA 的细胞信号降低了 77% 至 97%。值得注意的是，当细胞转染 CDK2 siRNA 时，在总 CDK6 检测中观察到的微小信号降低是预期的，因为 CDK2 敲低会导致 CDK6 下调（Bačević等人，《科学报告》，2017 年；7:13429）。综上所述，这些数据表明 HTRF 总 CDK2、总 CDK4 和总 CDK6 检测对每种激酶具有特异性，且不会与其他细胞周期 CDK 家族成员发生交叉反应。

total-CDK4-cellular-kit（总 CDK4 细胞试剂盒）

人源和小鼠细胞系中总 CDK4 水平的评估

将人源细胞系 HEK293、MCF-7 和 HeLa 以及小鼠细胞系 NIH-3T3 在 T175 培养瓶中培养 48 小时，然后用 3mL 补充的 1 号裂解缓冲液（1X）裂解。通过将 16µL 样品转移至 384 孔小体积白色微孔板中并加入 4µL HTRF 总 CDK4 检测抗体，分析每种细胞裂解物的总 CDK4 含量。过夜孵育后记录 HTRF 信号。

total-CDK4-cellular-kit（总 CDK4 细胞试剂盒）

HTRF 总 CDK4 检测与蛋白质印迹法的比较

将 HEK293 细胞在 T175 培养瓶中的完全培养基中于 37°C、5% CO₂条件下培养。孵育 48 小时后，用 3mL 补充的 1 号裂解缓冲液（1X）在室温下轻轻振荡 30 分钟以裂解细胞。

使用补充的裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，将 16µL 每种稀释液转移至小体积白色微孔板中，然后加入 4µL HTRF 总 CDK4 检测试剂。使用等量的裂解物对 HTRF 检测与蛋白质印迹法进行平行比较。

使用 HTRF 总 CDK4 检测时，400 个细胞 / 孔就足以检测到显著信号，而使用蛋白质印迹法获得最小化学发光信号也需要相同数量的细胞。因此，在这些条件下，HTRF 总 CDK4 检测的灵敏度与蛋白质印迹技术相当。

total-CDK4-cellular-kit-8.svg（总 CDK4 细胞试剂盒 - 8.svg）

简化通路

CDK4 在细胞分裂周期中的作用

CDK4（细胞周期蛋白依赖性激酶 4）是协调哺乳动物细胞周期进程的 CDK 亚家族成员（该亚家族还包括 CDK1、CDK2 和 CDK6）。

有丝分裂原信号（如生长因子）通过诱导周期蛋白 D 的合成，触发细胞进入细胞周期的 G1 期。周期蛋白 D 随后与 CDK4 和 CDK6 相互作用形成活性复合物。这两种激活的激酶能够对肿瘤抑制因子视网膜母细胞瘤（RB）蛋白进行单磷酸化，此时 RB 仍与转录因子 E2F 结合，但部分基因可被转录，如周期蛋白 E。在 G1 期晚期和 S 期早期，周期蛋白 E 与 CDK2 相互作用并激活 CDK2，CDK2 进而磷酸化 RB 上的其他位点，导致其完全失活。因此，S 期进程所需的 E2F 应答基因被诱导表达，如周期蛋白 A，随后周期蛋白 A 与 CDK2 相互作用形成周期蛋白 A/CDK2 复合物。CDK2 最终磷酸化 Cdc25B 和 Cdc25C 磷酸酶，这些磷酸酶进而激活 CDK1，而 CDK1 是细胞分裂周期中 G2 期和 M 期进程所必需的。

total-CDK4-cellular-kit（总 CDK4 细胞试剂盒）

规格

其他规格

应用：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
兼容的裂解缓冲液：1 号裂解缓冲液、4 号裂解缓冲液、5 号裂解缓冲液
分子修饰：总量
产品类别：试剂盒
样品体积：16µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷蛋白
靶标物种：人、小鼠
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域：肿瘤学与炎症
单位规格：10,000 个检测点

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货号：64CDK4TPEH

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